pBV220-HPVL1和pBV220-HSVgD重組蛋白的高效表達(dá)、分離純化及其鑒定.pdf

1、目的: 人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)感染是引起宮頸癌的主要病因，高危型HPV16是主要的感染類型。而HPV并非宮頸癌發(fā)生發(fā)展的唯一因素，單純皰疹病毒(Herpessimplex virus，HSV)可能作為協(xié)同因子在宮頸癌變發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中起重要作用。用PCR法從HPV中擴(kuò)增出L1基因片段及從HSV中擴(kuò)增出gD基因片段作為目的基因，并將目的基因插入到pBV220原核表達(dá)載體中；為了獲得pBV2

2、20-HPVL1和pBV220一HSVgD重組蛋白，故將上述重組載體在E.coli DH5α中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)、蛋白純化及其鑒定，以期為研制宮頸癌預(yù)防性疫苗奠定基礎(chǔ)。 方法: 重組質(zhì)粒pBV220-HPVL1和pBV220-HSVgD轉(zhuǎn)化E.coil DH5a，溫控誘導(dǎo)，以包涵體形式獲高效表達(dá)。在超聲液中加入終濃度為2mol/L的尿素分離洗滌包涵體，然后將其溶于8mol/L尿素中，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度。將一定量的目的蛋

3、白與免疫佐劑混合后免疫家兔。免疫方式采用皮下多點(diǎn)注射，經(jīng)7次免疫后，取兔耳緣靜脈血行雙向瓊脂免疫擴(kuò)散法檢測(cè)抗體滴度，滴度合適后，進(jìn)行心臟采血。采集分離的血清進(jìn)行雙向瓊脂免疫擴(kuò)散，此外，用Western-blot檢測(cè)和鑒定pBV220-HPVL1和pBV220-HSVgD目的蛋白。 結(jié)果: 1、將重組質(zhì)粒pBV220-HPVL1和pBV220-HSVgD轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，分別經(jīng)42℃誘導(dǎo)表達(dá)6小時(shí)和5小時(shí)，成功表達(dá)了相

4、應(yīng)的pBV220-HPVL1和pBV220-HSVgD重組蛋白。SDS-PAGE分析表明：兩者均以包涵體形式存在，pBV220-HPVL1重組蛋白的分子量約為64KD，pBV220-HSVgD重組蛋白的分子量約為13KD。 2、將包涵體超聲裂解、分離沈滌后，獲得了較純的目的蛋白，經(jīng)8M尿素處理后，紫外吸收法測(cè)定HPVL1與HSVgD蛋白濃度分別為5.9mg/ml與4.6mg/ml。 3、以pBV220-HPVL1和pBV

5、220-HSVgD重組蛋白分別免疫家兔，制備了抗HPVL1、HSVgD多克隆抗體，以重組蛋白為抗原，用雙向瓊脂免疫擴(kuò)散法檢測(cè)HPVL1、HSVgD抗血清的效價(jià)均達(dá)到1:16，且HPVL1、HSVgD抗體與免疫原之間形成單一沉淀線，表明所制備的多抗具有良好的純度。 4、免疫印跡分析HPVL1抗血清在分子量約64KD，HSVgD抗血清在分子量約13KD處與相應(yīng)的原核表達(dá)蛋白呈現(xiàn)特異性結(jié)合條帶，表明所表達(dá)的蛋白均為目的蛋白。