人7型腺病毒下調(diào)CXCL1基因轉(zhuǎn)錄及其作用機(jī)制的研究.pdf

1、據(jù)世界衛(wèi)生組織調(diào)查，大約有1/5的人腺病毒感染是由7型腺病毒(AdenovirusType7，Ad7)引起的，7型腺病毒屬于BI亞屬腺病毒。它感染力和致病性較其它型腺病毒嚴(yán)重，可引起致死性肺炎。青年人腺病毒肺炎的病死率為8％～10％，多由腺病毒7型引起。目前對Ad7研究的甚少，病毒感染致病機(jī)理尚未清楚。Ad7所導(dǎo)致的致死性肺炎與肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(A549細(xì)胞)的免疫炎性反應(yīng)可能有某種聯(lián)系。為此，了解Ad7對肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞免疫分子基因轉(zhuǎn)

2、錄的影響，這對了解Ad7感染致病機(jī)制的研究有一定的幫助?；蛐酒夹g(shù)是一種具有高通量、高效率、低消耗的分子生物學(xué)技術(shù)，它能夠在同一時(shí)間內(nèi)，通過少量標(biāo)本，實(shí)現(xiàn)生物基因信息的大規(guī)模檢測，通過比較正常和疾病狀態(tài)下的基因轉(zhuǎn)錄及其表達(dá)的差異，尋找和發(fā)現(xiàn)與該疾病相關(guān)的候選基因，有可能揭示疾病發(fā)生過程中的多個(gè)作用環(huán)節(jié)，同時(shí)也能為疾病的診斷和治療提供分子生物學(xué)方面的證據(jù)。為此，本論文以Ad7感染A549細(xì)胞24h后，先用基因芯片篩選出病毒感染宿主細(xì)胞后

3、與對照組比較差異表達(dá)的基因，再從差異表達(dá)顯著的基因中選出部分基因，用RT-PCR技術(shù)對基因芯片結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。最后發(fā)現(xiàn)CXCL1在病毒感染12h、24h后基因轉(zhuǎn)錄下調(diào)，之后對該基因轉(zhuǎn)錄的下調(diào)進(jìn)行作用機(jī)制的研究，從而為Ad7感染致病機(jī)制提供新的思路和線索。
　　目的:
　　通過基因芯片技術(shù)和RT-PCR技術(shù)，篩選出Ad7感染A549細(xì)胞后基因轉(zhuǎn)錄差異表達(dá)的基因，之后對篩選出來的差異轉(zhuǎn)錄基因CXCL1轉(zhuǎn)錄的下調(diào)進(jìn)行機(jī)制研究，為研究

4、Ad7感染致病的分子機(jī)制提供新的思路和線索。
　　方法:
　　1、基因芯片初篩通過SuperArray基因芯片技術(shù)，使用含260個(gè)基因的人抗原呈遞細(xì)胞基因芯片初步篩選Ad7感染A549細(xì)胞24h后與正常A549細(xì)胞相比差異表達(dá)的基因。方法應(yīng)用TRIzol法分別提取正常（A組）、病毒感染（B組）總RNA;紫外吸收測定法進(jìn)行RNA質(zhì)量檢測;rueLabeling-AMPTM線性RNA擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行cRNA標(biāo)記與合成;芯片雜交;化

5、學(xué)發(fā)光檢測試劑盒進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測;最后是圖象采集和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。
　　2、RT驗(yàn)證從芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇轉(zhuǎn)錄上調(diào)基因CCL11、CCL16、HLA-G;轉(zhuǎn)錄下調(diào)基因CXCL1、CXCL2、HLA-A，設(shè)計(jì)好相對應(yīng)的RT-PCR引物，選擇病毒感染細(xì)胞4h、12h、24h這三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，另設(shè)立對照組。用TRIZOL進(jìn)行總RNA的提取，通過RT-PCR對基因芯片的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，進(jìn)一步更準(zhǔn)確的篩選出Ad7感染A549細(xì)胞后差異表達(dá)的基因。

6、>　　3、機(jī)制研究
　　1)機(jī)制一—Ad7的E1A基因通過細(xì)胞脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將構(gòu)建好的能在真核細(xì)胞高表達(dá)EIA的重組pIRES-Neo-Ad7E1A質(zhì)粒即E1A(+)質(zhì)粒，對照組EGFP質(zhì)粒即E1A(-)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞48h后于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光表達(dá)量，之后用TRIZOL進(jìn)行總RNA的提取，RT-PCR技術(shù)檢測兩組細(xì)胞CXCL1 mRNA相對表達(dá)情況，觀察Ad7-EIA基因?qū)XCL1基因轉(zhuǎn)錄的影響。
　　2)機(jī)

7、制二—核轉(zhuǎn)運(yùn)因子NF-κB Ad7感染A549細(xì)胞4h、24h，設(shè)立對照組，用染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)檢測細(xì)胞NF-κB與CXCL1啟動(dòng)子結(jié)合程度。
　　結(jié)果:
　　1、選取Ad7感染A549細(xì)胞24h后與正常A549細(xì)胞，進(jìn)行抗原呈遞細(xì)胞基因芯片檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ad7感染A549細(xì)胞24h后較正常細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)2倍以上的基因有5個(gè)，基因轉(zhuǎn)錄下調(diào)2倍以上的基因有12個(gè)。
　　2、RT-PCR的結(jié)果表明是在Ad7感染A549細(xì)

8、胞12h、24h后與對照組的A549細(xì)胞相比，CXCL1基因轉(zhuǎn)錄下調(diào)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義
　　3、機(jī)制一—Ad7的E1A基因兩質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞48h后于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達(dá)量為70％，轉(zhuǎn)然效率已達(dá)到了實(shí)驗(yàn)要求，即成功的構(gòu)建了E1A(+)A549細(xì)胞和E1A(-)A549細(xì)胞。之后的RT-PCR結(jié)果表明E1A(+) A549細(xì)胞比E1A(-) A549細(xì)胞CXCL1基因mRNA水平表達(dá)明顯下調(diào)，具有顯著性差異。
　

9、　4、機(jī)制二—NF-κB Ad7感染A549細(xì)胞24h后與對照組細(xì)胞相比，NF-κB與CXCL1基因啟動(dòng)子結(jié)合明顯減少，具有顯著性差異，而感染4h與對照組相比，沒有顯著性差異。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論:
　　本實(shí)驗(yàn)揭示出Ad7感染A549細(xì)胞12h、24 h后，CXCL1基因轉(zhuǎn)錄下調(diào)。E1A轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)顯示E1A轉(zhuǎn)染的細(xì)胞比E1A未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞CXCL1基因轉(zhuǎn)錄下調(diào);ChIP實(shí)驗(yàn)表明病毒感染細(xì)胞24h后，NF-κB與CXCL1基因啟動(dòng)子結(jié)合