甲潑尼龍琥珀酸鈉對腎上腺素致大鼠神經源性肺水腫肺組織中的AQP5表達的影響.pdf

1、神經源性肺水腫(Neurogenic Pulmonary Edema，NPE)是中樞神經系統(tǒng)(CNS)疾病的嚴重并發(fā)癥之一。是指無原發(fā)性心、肺、腎等疾病，由中樞神經系統(tǒng)疾?。ㄈ顼B腦損傷等）引起的突發(fā)性的顱內壓增高而導致的肺水腫，也稱中樞性肺水腫。近年來，常由發(fā)病率顯著升高的重癥手足口病(EV71感染)導致，使過多的液體蓄于肺間質或肺泡內，形成間質性或肺泡性肺水腫。重癥手足口病所致神經源性肺水腫的臨床表現(xiàn)為呼吸困難、呼吸窘迫、咳粉紅色泡沫

2、痰、咯血、呼吸循環(huán)衰竭等急性癥狀，其發(fā)病急，病情較兇險，進展迅猛，治療困難、死亡率高(90％)。在醫(yī)學界，對NPE發(fā)病機制的研究一直是比較活躍的一個領域，盡管有許多學者對此已經做了大量的研究工作，但神經源性肺水腫的確切機理至今仍不十分清楚。在其病理改變中，肺部通透性增加是一個特征性的表現(xiàn)。
　　 AQP5廣泛分布于肺泡Ⅰ型上皮細胞的腔頂面，還位于鼻咽和呼吸道黏膜下腺上皮細胞腔頂面及氣道上皮細胞腔膜面，AQP5在肺組織中表達最多。

3、是肺組織水轉運功能中液體快速轉運的通道，對維持肺組織的正常生理功能、肺水轉運中起到不可低估的作用。甲潑尼龍琥珀酸鈉是人工合成的糖皮質激素，在治療手足口病中，是一種常用的物，藥作用時間屬中效類，具有強大的抗炎作用，可以改善神經傳導功能，減輕炎癥和水腫，減少兒茶酚胺的縮血管功能和血栓的形成，能降低毛細血管通透性，減輕肺水腫，同時有效防治腦水腫，阻斷肺水腫-腦水腫的惡性循環(huán)。本實驗通過觀察不同劑量的甲強龍（甲潑尼龍琥珀酸鈉）對腎上腺素誘導的神

4、經源性肺水腫大鼠肺組織AQP5的表達、病理形態(tài)學、濕干重比值等的影響，探討其對神經源性肺水腫的保護作用，為其臨床應用提供理論依據(jù)。
　　 目的:
　　 觀察不同劑量的甲潑尼龍琥珀酸鈉對腎上腺素誘導的神經源性肺水腫大鼠肺組織AQP5的表達、病理形態(tài)學、濕干重比值等的影響，探討其對神經源性肺水腫是否具有保護性作用差異。
　　 方法:
　　 1、動物模型的制備
　　 Wistar大鼠雌雄不拘，1月齡，體

5、重100±8g，腹腔注射腎上腺素造模型，神經源性肺水腫組大鼠按2.7mg/kg給予腹腔注射腎上腺素注射液(1mg∶1ml)，觀察20min左右，大多數(shù)大鼠腹腔注射后約5 min左右出現(xiàn)呼吸頻率加快、弓背，15 min可見呼吸困難，若存活時間大于20min者，則造模成功。以10％水合氯醛腹腔注射麻醉，將麻醉后的大鼠臥位置于操作臺上，去毛。取上腹正中切口，打開胸腔，結扎氣管，取出雙肺。
　　 2、動物分組
　　 將Wista

6、r大鼠50只，隨機分為正常對照組(n=10)、神經源性肺水腫組(NPE組，n=10)、甲強龍治療組(n=30)，后又以不同劑量分為三個亞組，每個亞組10只大鼠。其中甲強龍治療組于造模后立即腹腔注射。
　　 3、肺形態(tài)觀察
　　 麻醉大鼠后，迅速開胸，暴露氣管，用線扎住氣管下端把肺完整地取下，觀察肺的顏色和形態(tài)。
　　 4、肺濕干重比檢測
　　 用吸水紙吸干大鼠右肺中葉表面水分和血液，電子天平稱濕重。將右肺

7、中葉置于65℃烘箱內72h至恒重，再稱干重，計算右肺中葉濕/干重比值(W/D)。
　　 5、病理形態(tài)學觀察
　　 分別取左肺放入4％甲醛中固定，4℃存放至肺組織沉到瓶底，之后脫水、透明、包埋、石蠟切片，然后進行HE染色，觀察肺組織病理學改變。
　　 6、肺組織AQP5免疫組化染色
　　 采用鏈霉素-親合素-生物素過氧化物酶法(SABC)。切片經常規(guī)脫蠟、水化后，用3％過氧化氫去除內源性氧化酶，微波抗原修復

8、，余步驟按試劑盒說明書進行。用已知陽性片作為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。AQP5抗體稀釋濃度為1∶400。光鏡下出現(xiàn)細胞胞質呈棕黃色著染者為陽性表達細胞。每張切片隨機選擇10個視野(200×)測定其吸光度值(absorbance，A)，計算平均A值反映其表達強弱。
　　 7、實時定量PCR方法檢測AQP5mRNA表達
　　 取右肺上葉組織，采用TRIzol試劑（購自invitrogen公司）參照說明書提取各組

9、大鼠的肺細胞總RNA，再逆轉錄成cDNA，以適量cDNA為模板。將配制好的PCR反應溶液置于Realtime PCR儀上進行PCR擴增反應。反應條件相同。AQP5引物（由invitrogen公司合成），引物序列:GAPDHβ-actin:上游引物5’-GGCATGGACTGTGGTCATGA-3’;下游引物5’-TTCACCACCATGGAGAAGGC-3’;(244bp)，AQP5上游引物5’-GTGACAGACAAGCCAATGGA

10、TAA-3’;下游引物5’-GCCCTCTTAATAGGAAACCAGAT-3’(287bp)。
　　 8、AQP5 Western blot
　　 取右肺下葉組織500mg加上1ml提取液用玻璃勻漿器勻漿后提取，4℃，12000r/min，離心5min，取上清液，然后加入等體積的2xSDS上樣緩沖液，在100℃水中煮沸5 min。進行凝膠電泳，每孔上樣等量的總蛋白。將蛋白轉移至PVDF膜上。用5％脫脂奶粉封閉2h后，加

11、入1∶250的第一抗體過夜，再加入1∶6500 HRP標記的第二抗體，室溫振搖2h，ECL顯色。使用Gel-pro凝膠分析軟件，測定其平均光密度值(OD值)，以光密度值代表AQP5蛋白的表達量。待測AQP5蛋白表達量與內參照β-actin(GAPDH)表達量進行對比，表示AQP5蛋白的相對表達水平。
　　 結果:
　　 1、大鼠一般情況觀察
　　 NPE組大鼠較對照組呼吸明顯加快、躁動，大鼠雙肺底可聞及濕羅音;各

12、不同劑量甲強龍(Methylprednisolone MP)治療組大鼠呼吸無明顯加快、躁動，主要表現(xiàn)為活動減少，存活時間延長。
　　 2、肺組織形態(tài)學觀察
　　 對照組的肺外觀呈白色，較實，沒有水腫。NPE組雙肺體積明顯增大、水腫、淤血、表面分布大片狀暗紅色出血灶，氣管內可見泡沫樣液體。甲強龍各治療組較NPE組雙肺體積減小，水腫減輕，肺表面散在點狀或小片狀暗紅色出血灶?？梢婋S治療量增加，出血、水腫明顯減輕。
　　

13、 3、肺W/D重比值
　　 NPE組W/D(6.6080±0.4319)與對照組(4.0870±0.5279)相比，明顯升高(P＜0.05)，各甲強龍治療組W/D比NPE組明顯降低(P＜0.05)，三組相比(5.8279±0.8050)、(5.2430±0.3359)、(4.5900±0.5390)，MP30mg/kg治療組W/D最低(P＜0.05)。
　　 4、肺組織病理學改變
　　 對照組肺泡腔無充血、出血，

14、肺泡結構清晰。NPE組在光鏡下肺泡失去正常的結構，肺泡壁增寬，肺泡過度擴張，肺泡腔充滿大量出血及炎性細胞。各MP治療組與NPE組相比，病理改變明顯減輕。
　　 5、肺組織AQP5免疫組化染色
　　 免疫組織化學染色結果以IOD值表示AQP5蛋白表達的相對強度，正常對照組肺組織中AQP5在肺泡Ⅰ型上皮細胞的腔頂面有廣泛而強烈的表達。NPE組（0.0784±0.0095）與對照組（0.5572±0.0834）相比，AQP5蛋

15、白表達較對照組減少，染色變淺，AQP5表達明顯減弱(P＜0.05);甲強龍各治療組A組、B組、C組(0.2385±0.0676)(0.3441±0.0673)(0.4432±0.0653)較NPE組（0.0784±0.0095）AQP5表達顯著加強(P＜0.05);A組、B組、C組(0.2385±0.0676)、(0.3441±0.0673)、(0.4432±0.0653)三組相比，C組(0.4432±0.0653)AQP5密度最高，有

16、統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 6、AQP5mRNA表達水平
　　 在287bp處可見AQP5mRNA表達，NPE組與對照組相比，AQP5表達明顯減弱(P＜0.05);甲強龍各治療組較NPE組AQP5表達顯著加強(P＜0.05);A組、B組、C組三組相比，C組AQP5 mRNA表達水平最高，有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 7、AQP5蛋白表達水平
　　 NPE組（0.2165±0.0202）肺組

17、織 AQP5表達與對照組（0.6470±0.1518）相比，AQP5表達明顯減少(P＜0.05);甲強龍各治療組A組、B組、C組（0.3641±0.0202）（0.3788±0.1347）（0.5243±0.0937）肺組織AQP5表達較NPE組（0.2165±0.0202）AQP5表達明顯增強（P＜0.05）;A組、B組、C組（0.3641±0.0202））（0.3788±0.1347）（0.5243±0.0937）三組相比，C組（0

18、.5243±0.0937）表達明顯增強，有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 結論:
　　 1、給予腹腔注射腎上腺素注射液(1mg∶1ml)，肉眼可見NPE組雙肺體積明顯增大、水腫、淤血、表面分布大片狀暗紅色出血灶，氣管內可見泡沫樣液體。HE染色發(fā)現(xiàn)對照組肺泡腔無充血、出血，肺泡結構清晰。NPE組在光鏡下肺泡失去正常的結構，肺泡壁增寬，肺泡過度擴張，肺泡腔充滿大量出血及炎性細胞。且肺濕/干重比明顯增加，綜上說明大鼠NPE

19、模型制備成功。
　　 2、腎上腺素誘導的神經源性肺水腫大鼠肺組織AQP5表達較正常對照組顯著降低，提示AQP5在肺臟的水液平衡中起作用，在神經源性肺水腫時是一種保護蛋白。因而我們推測AQP5的表達減少導致肺泡水清除率能力下降，推測可能導致神經源性肺水腫的形成。
　　 3、在應用甲潑尼龍琥珀酸鈉治療后可使神經源性肺水腫大鼠肺濕/干比值(W/D)降低，AQP5表達上升，肺水腫減輕，說明甲潑尼龍琥珀酸鈉對AQP5的表達有上調作