犬新孢子蟲(chóng)吉林株SAG1基因的真核表達(dá)及免疫學(xué)評(píng)價(jià).pdf

1、新孢子蟲(chóng)?。∟eosporiasis）是由犬新孢子蟲(chóng)（Neosporacaninum）寄生于多種動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)而引起孕畜流產(chǎn)、死胎以及新生胎兒運(yùn)動(dòng)神經(jīng)系統(tǒng)紊亂的一種原蟲(chóng)病。該病對(duì)牛的危害尤為嚴(yán)重，已經(jīng)給養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。而目前尚未有有效的治療藥物和疫苗來(lái)控制該病的發(fā)生和發(fā)展，因此疫苗的研究是當(dāng)前研究新孢子蟲(chóng)病的熱點(diǎn)問(wèn)題。
　　本試驗(yàn)根據(jù) GenBank中已發(fā)表的犬新孢子蟲(chóng) SAG1基因的核苷酸序列(AF132217)，設(shè)計(jì)、

2、合成了一對(duì)含有 Kozak序列、起始密碼子、終止密碼子、Bam HⅠ和Eco RⅠ酶切位點(diǎn)的特異性引物，采用PCR技術(shù)擴(kuò)增犬新孢子蟲(chóng)SAG1基因片段，克隆到 pMD18-T simple載體上，進(jìn)行 PCR、酶切鑒定及序列分析。將鑒定正確的SAG1基因片段克隆至pVAX1真核表達(dá)載體中，PCR、酶切鑒定及序列分析后轉(zhuǎn)染至 BHK21細(xì)胞，應(yīng)用 IFAT和 RT-PCR方法檢測(cè)重組質(zhì)粒在 BHK21細(xì)胞中表達(dá)情況。最后將提取重組質(zhì)粒pVA

3、X-SAG1免疫BALB/c小鼠，應(yīng)用間接ELISA和流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)體液免疫水平和細(xì)胞免疫水平。
　　結(jié)果表明，克隆的SAG1基因片段長(zhǎng)780bp,編碼260個(gè)氨基酸，與已發(fā)表的美國(guó)株犬新孢子蟲(chóng) SAG1基因核苷酸序列(AF132217)的同源性為99％，氨基酸序列同源性為98.8%。IFAT和RT-PCR證實(shí)重組質(zhì)粒在BHK21細(xì)胞中獲得表達(dá)。表達(dá)的重組質(zhì)粒pVAX-SAG1免疫BALB/c小鼠后，誘導(dǎo)產(chǎn)生的體液免疫水平顯著高