犬新孢子蟲吉林株GRA7基因的克隆及原核表達.pdf

1、新孢子蟲病是目前危害養(yǎng)牛業(yè)健康發(fā)展的主要原蟲病，該病主要造成孕牛流產(chǎn)、死胎以及新生犢牛的運動神經(jīng)系統(tǒng)障礙。目前，國內(nèi)外對新孢子蟲病的防控尚無有效的方法。因此，篩選抗原基因，制備基因工程疫苗預防新孢子蟲病的發(fā)生與發(fā)展仍是當前的首要問題。
　　GRA7基因是犬新孢子蟲的主要致密顆粒蛋白基因，致密顆粒蛋白具有較好的免疫原性，可作為疫苗的免疫原來預防新孢子蟲病。本試驗根據(jù)GenBank（AF176649）上發(fā)表的犬新孢子蟲GRA7基因序列

2、設計一對含有Xho I和EcoR I雙酶切位點的特異性引物，PCR擴增犬新孢子蟲吉林株GRA7基因，純化PCR產(chǎn)物后，克隆至pMD18-T simple載體上，進行PCR鑒定、酶切鑒定及序列分析，并與GenBank中已發(fā)表的序列進行同源性比較及抗原蛋白預測分析。將鑒定正確的GRA7基因與pGEX-4T-1表達載體連接，構(gòu)建GRA7基因原核表達載體，在大腸桿菌中經(jīng)IPTG誘導表達，應用SDS-PAGE和Western blotting技術(shù)

3、檢測表達蛋白的反應原性。
　　結(jié)果表明，PCR擴增出大小為701 bp的GRA7基因片斷；所克隆的犬新孢子蟲吉林株GRA7基因與已發(fā)表的序列同源性達98％，經(jīng)抗原蛋白預測分析該基因表達的蛋白抗原指數(shù)較高；將GRA7基因定向克隆到pGEX-4T-1表達載體中，經(jīng)酶切鑒定和PCR鑒定，證明成功構(gòu)建了原核表達質(zhì)粒pGEX-GRA7；經(jīng)SDS-PAGE和Western blotting檢測證實，所表達出來的GRA7融合蛋白分子量約為51k