鹵代醌類化合物介導(dǎo)肝細(xì)胞炎癥反應(yīng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡的信號通路分析.pdf

1、鹵代醌類化合物是環(huán)境中廣泛存在的一類持久有機(jī)污染物，它們主要由多鹵代芳香族化合物通過化學(xué)反應(yīng)、酶促反應(yīng)以及生物體內(nèi)代謝等多種途徑脫鹵形成，在以上過程中形成了大量中間產(chǎn)物，這些中間產(chǎn)物多具有細(xì)胞毒性、遺傳毒性、神經(jīng)毒性、免疫毒性等多種毒性效應(yīng)，嚴(yán)重威脅著人類健康。
　　本課題分為兩個部分，從體內(nèi)和體外水平揭示鹵代醌類化合物的毒性機(jī)制，為完善鹵代醌類化合物毒性機(jī)制提供新的內(nèi)容，為鹵代醌類化合物引起疾病的預(yù)防和治療提供新的思路。

2、　　第一部分:姜黃素拮抗四氯苯醌誘導(dǎo)小鼠肝損傷的機(jī)制研究
　　四氯苯醌(TCBQ)由廣泛應(yīng)用的木材防腐劑五氯酚(PCP)代謝產(chǎn)生，代謝過程發(fā)生氧化還原反應(yīng)，并由此產(chǎn)生大量的活性氧(ROS)，從而造成機(jī)體氧化損傷。肝臟是人體主要的代謝與解毒器官，TCBQ在體內(nèi)代謝可能會造成肝臟損傷。
　　姜黃素(Curcumin)是從姜黃根莖中提取的一種天然多酚產(chǎn)物，具有抗炎、抗氧化、清除氧自由基、抗凝、降血脂、抗動脈粥樣硬化等多種藥理作用。

3、它抗氧化與清除自由基的作用能夠保護(hù)機(jī)體免受氧化應(yīng)激的損傷。同時，在本實驗中研究了姜黃素拮抗四氯苯醌誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷的作用機(jī)制。
　　本實驗利用四氯苯醌(TCBQ)建立小鼠急性肝損傷模型，把32只昆明小鼠隨機(jī)分為四組，每組8只:對照組、姜黃素組、TCBQ組和TCBQ+姜黃素組。對照組小鼠給予等量的溶劑，姜黃素組小鼠連續(xù)5天給予姜黃素，TCBQ組小鼠給予單劑量的TCBQ，TCBQ+姜黃素組小鼠連續(xù)5天腹腔注射給予姜黃素，在最后一次給

4、予姜黃素3小時后腹腔注射給予TCBQ，24小時后取小鼠血清及肝臟檢測肝臟損傷相關(guān)指標(biāo)。在血清中檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)水平，在肝臟中檢測TBARS、SOD、CAT水平。這些結(jié)果顯示四氯苯醌對小鼠肝臟造成了嚴(yán)重的損傷。HE染色觀察肝臟病理學(xué)變化，結(jié)果顯示TCBQ組中有大量的炎癥細(xì)胞浸潤，說明在這肝臟中存在炎癥反應(yīng)。iNOS、COX-2免疫組化和p65、TNF-α、IL-6、IL-1β、IκB、P-IκB

5、 Western blot結(jié)果進(jìn)一步證明了四氯苯醌誘導(dǎo)的肝損傷主要為炎癥反應(yīng)。進(jìn)一步考察了凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Caspase3、Caspase8、Caspase9的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)TCBQ組中這些蛋白的表達(dá)與其它組相比沒有明顯變化。Cleaved Caspase3免疫組化結(jié)果也無明顯變化。這表明四氯苯醌不引起肝細(xì)胞凋亡。
　　有研究表明，姜黃素的保護(hù)作用歸因于它清除自由基的能力，因此，我們選取重要的抗氧化信號通路Nrf2/K

6、eap1/ARE作為研究對象。實驗結(jié)果顯示姜黃素激活了Nr2/Keap1/ARE信號通路，對四氯苯醌誘導(dǎo)的急性肝損傷發(fā)揮了較好的拮抗作用。
　　以上研究表明四氯苯醌誘導(dǎo)的急性肝損傷主要為炎癥反應(yīng)，但不引起肝細(xì)胞凋亡。姜黃素通過激活Nrf2/Keap1/ARE信號通路，調(diào)節(jié)Ⅱ相代謝酶HO-1、NQO1在肝組織的表達(dá)，從而達(dá)到保護(hù)肝臟的作用。
　　第二部分:多氯聯(lián)苯醌通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的機(jī)制分析
　　

7、多氯聯(lián)苯醌(PCBQ)是氯代芳香族化合物多氯聯(lián)苯(PCBs)的主要代謝產(chǎn)物。近年有研究報道，PCBs代謝產(chǎn)物可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而造成氧化損傷。而氧化應(yīng)激反應(yīng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)和凋亡有密切聯(lián)系，這就提示多氯聯(lián)苯醌可能引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)及凋亡。
　　本實驗選用人肝癌HepG2細(xì)胞作為研究對象，以考察多氯聯(lián)苯醌是否能夠在HepG2細(xì)胞中誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)及凋亡的發(fā)生。首先，在熒光顯微鏡和透射電鏡下觀察HepG2細(xì)胞及其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

8、在未加PCB29-pQ與加入10μM PCB29-pQ處理48 h后的形態(tài)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在給藥組細(xì)胞中出現(xiàn)了凋亡及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的典型特征。然后從濃度梯度和時間梯度上分別考察PCB29-pQ誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，并用RT-PCR分析基因Bip、GRP94、XBP-1的mRNA表達(dá)水平。與對照組相比，PCB29-pQ處理的細(xì)胞相應(yīng)蛋白和基因的表達(dá)量均有明顯提高。用流式細(xì)胞儀檢測PCB29-pQ引起細(xì)胞內(nèi)鈣水平的變化。實驗結(jié)果表明P

9、CB29-pQ能夠提高細(xì)胞內(nèi)鈣水平。這些結(jié)果說明了PCB29-pQ能夠誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。在形態(tài)學(xué)考察中發(fā)現(xiàn)PCB29-pQ處理的細(xì)胞有明顯的凋亡現(xiàn)象，因此，根據(jù)文獻(xiàn)報道選取了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)中三條參與凋亡調(diào)控的信號通路:PERK/eIF2α/ATF4/CHOP、Caspase12/Caspase9/Caspase3和IRE1α/JNK/c-Jun進(jìn)行研究。一系列實驗結(jié)果證明，PCB29-pQ通過激活PERK/eIF2α/A

10、TF4/CHOP、Caspase12/Caspase9/Caspase3信號通路誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡。接著用加入鈣離子螯合劑BAPTA-AM和ROS清除劑NAC的方法以考察PCB29-pQ引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的原因。結(jié)果表明，PCB29-pQ引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激受細(xì)胞內(nèi)鈣離子和ROS水平的調(diào)節(jié)。
　　根據(jù)以上研究可知，PCB29-pQ能夠誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，并受細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度和ROS水平的調(diào)節(jié)。PCB29-pQ引起的凋亡受