索拉非尼對肝癌細(xì)胞株HepG-,2-的放療增敏作用.pdf

1、研究的背景和目的： 肝癌是我國主要的惡性腫瘤，年發(fā)病率為10-150/10萬人。在全世界也屬于常見病，每年新發(fā)原發(fā)性肝癌約26萬例。我國每年死于肝癌約11萬人，占全世界肝癌死亡人數(shù)的45％。大多數(shù)肝癌患者就診是已是中晚期，手術(shù)率僅有5％-10％左右。隨著放射治療設(shè)備與技術(shù)的發(fā)展，適形放療技術(shù)在臨床中的應(yīng)用，放射治療已逐漸成為非手術(shù)治療肝癌的主要方法之一。然而，由于肝癌細(xì)胞的相對輻射抗拒性，使得肝癌的根治劑量明顯高于肝臟的耐受劑量

2、，尤其中晚期肝癌多數(shù)有肝病基礎(chǔ)，又限制了放療劑量的提高，導(dǎo)致肝癌放療效果不佳。因此，如果能選擇可以增加肝癌細(xì)胞的輻射敏感性(Radiosensitivity)的藥物與放療聯(lián)合應(yīng)用，從而相對提高肝臟耐受劑量是提高中晚期肝癌療效的重要手段之一，在臨床應(yīng)用中具有重要的臨床價值。 放療增敏藥物的研究，一直都受到關(guān)注，早期研究的親電子類的硝基化合物因毒性大而在臨床的應(yīng)用中受到限制。對放療增敏機制的進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的放射敏感性與細(xì)胞

3、內(nèi)在的分子機制有關(guān)，因而對能特異性作用于腫瘤血管生成及信號傳導(dǎo)通路的分子靶向治療藥受到重視并成為研究熱點，相關(guān)的研究結(jié)果顯示了未來放療增敏的發(fā)展?jié)摿Α?分子靶向藥物是近來腫瘤內(nèi)科治療領(lǐng)域的重大進(jìn)展之一。并在一些腫瘤的治療中取得重大的突破。但分子靶向藥物與放療的聯(lián)合應(yīng)用，目前相關(guān)的研究報道不多。隨著對放射敏感基因的進(jìn)一步研究和認(rèn)識，分子靶點以及細(xì)胞信號通路與放射敏感性的關(guān)系也受到了較多的關(guān)注。有報道認(rèn)為細(xì)胞的P13K/Akt信號傳

4、導(dǎo)路徑在細(xì)胞放射敏感性的作用有非常重要的意義。而RAS/RAF/ERK信號通路與腫瘤細(xì)胞放射敏感性的關(guān)系則是近來受到關(guān)注的另一條通路。近期的研究發(fā)現(xiàn)阻斷RAF-1或其介導(dǎo)的信號通路中其他信號分子位點，可以顯著提高部分輻射抵抗腫瘤的輻射敏感性。對于分子靶向藥物輻射增敏作用機制的認(rèn)識，有報道認(rèn)為分子靶向藥物輻射增敏作用的理論基礎(chǔ)與下列的機制相關(guān)：①抑制腫瘤細(xì)胞增殖和放射損傷的修復(fù)。腫瘤細(xì)胞受到輻射損傷后啟動的損傷修復(fù)機制與細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路中

5、的許多關(guān)鍵靶分子相關(guān)，分子靶向藥可以通過對這些靶分子活性抑制而輻射增敏作用。②使腫瘤細(xì)胞周期再分布。③細(xì)胞毒作用或誘導(dǎo)凋亡作用。許多分子靶向藥物都具有直接或間接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用使致克隆細(xì)胞數(shù)目減少，與放射聯(lián)合將發(fā)揮空間協(xié)同作用，從而提高放射的敏感性。④抑制腫瘤血管生成。主要針對內(nèi)皮細(xì)胞生長因子VEGF起作用。 甲苯磺酸索拉非尼片中文名又叫多吉美，是一種新型多靶點抗腫瘤藥物，是多激酶抑制劑(multi-kinaseinhibito

6、r)，其抗腫瘤作用機制為，一方面通過抑制RAF/MEK/ERK信號傳導(dǎo)通路直接抑制腫瘤生長；另一方面通過抑制VEGF和血小板衍生生長因子(PDGF)受體而阻斷腫瘤新生血管的形成，間接地抑制腫瘤細(xì)胞的生長。目前索拉非尼用于肝癌治療的3期臨床試驗已經(jīng)于2006年底完成。除肝癌與腎癌外，最近國內(nèi)的一些研究還進(jìn)行了索拉非尼對肺腫瘤、前列腺癌、惡性黑色素瘤以及乳腺癌的治療作用的探索。國外的文獻(xiàn)中有關(guān)索拉非尼聯(lián)合化療對腎癌、結(jié)腸癌的治療已有一些報道

7、，但索拉非尼聯(lián)合放療對肝癌細(xì)胞作用的有關(guān)研究國內(nèi)外目前均還未見報道。因此設(shè)想用實驗的方法觀察索拉非尼對體外培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞株HepG2的輻射增敏效應(yīng)。 方法： 1、用MTT實驗觀察藥物對細(xì)胞的生長抑制及殺傷作用，了解藥物不同濃度和作用時間對細(xì)胞的抑制作用程度，IC50值，并初步觀察藥物的不同濃度作用下的細(xì)胞存活曲線。 2、細(xì)胞克隆形成率實驗通過選擇合適的藥物濃度與不同放療劑量的聯(lián)合作用于細(xì)胞后觀察細(xì)胞的克隆形成集落

8、數(shù)量來觀察細(xì)胞的存活曲線，通過曲線的相關(guān)參數(shù)以及放射增敏比的比較來觀察藥物對肝癌細(xì)胞株HepG2的輻射增敏作用。 3、用PI染色法通過FCM檢測實驗處理后的細(xì)胞周期分布變化；用AnnexinV-FITC標(biāo)記染色及PI染色的雙染方法并通過FCM檢測分析實驗處理后的細(xì)胞凋亡率。初步探討索拉非尼對肝癌細(xì)胞株。HepG2輻射增敏作用的相關(guān)機制。 結(jié)果： 1、MTT實驗的結(jié)果顯示索拉非尼單獨使用時對HepG2細(xì)胞的具有抑制

9、作用，抑制作用程度與藥物濃度有關(guān)，還與作用時間有關(guān)，其作用3天、4天的IC50值分別為11.5ug/ml和8ug/ml。從細(xì)胞存活曲線實驗結(jié)果的看，其對細(xì)胞抑制作用的程度，是隨著藥物的濃度增加而增強，大致呈線性關(guān)系。從作用時間看，作用時間延長抑制作用的強度也加大。 2、細(xì)胞克隆形成率實驗結(jié)果：用9ug/mlSorafenib對照射后HepG2細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)(SF)按線型二次模型擬合曲線，為向左下略帶弧度的曲線。對兩條曲線的參數(shù)(a

10、、β、a/β)進(jìn)行比較(均P<0.05)顯示出了統(tǒng)計學(xué)意義。對存活分?jǐn)?shù)SF2比較，單純照射組為0.5125±0.0106，索拉非尼+照射組為0.4607±0.0094，經(jīng)兩樣本均數(shù)的比較，P=0.003(t=6.34，n=3)具有統(tǒng)計學(xué)差異；對2.0Gy照射劑量水平的輻射增敏比的比較，索拉非尼藥物+照射組的SER為：1.3478±0.0758，與單純照射組的SER(1.1753±0.0055)比較，P=0.017(t=-3.928，n=

11、3)，具有統(tǒng)計學(xué)意義。統(tǒng)計學(xué)分析的實驗數(shù)據(jù)表明，索拉非尼對肝癌細(xì)胞株HepG2具有的輻射增敏作用。 3、HepG2細(xì)胞經(jīng)加或不加索拉非尼進(jìn)行6.0Gy照射處理后，細(xì)胞周期分布結(jié)果顯示索拉非尼具有去周期阻滯的作用，加用索拉非尼后細(xì)胞被阻滯在G2/M期的比率與單純照射組比較明顯下降。細(xì)胞凋亡實驗則顯示，加用索拉非尼的照射組的凋亡率為：14.45±2.72比單純藥物(凋亡率為：10.37±2.28)或單純照射組(凋亡率10.06±1.

12、30的凋亡率明顯增加，方差分析(均P=0.008)顯示具有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論： 1、MTT實驗結(jié)果表明，索拉非尼單獨作用于肝癌細(xì)胞株HepG2具有對細(xì)胞生長抑制作用，其抑制的程度與藥物作用濃度有關(guān)系，隨藥物濃度的增加，抑制作用增強。還與藥物的持續(xù)作用時間有關(guān)系，在2-5天的作用時間內(nèi)，隨藥物的作用時間延長，對細(xì)胞的抑制作用也相應(yīng)增加。藥物對細(xì)胞的抑制作用與藥物的濃度類似線性關(guān)系。 2、克隆形成率實驗的結(jié)果表明，索