哮喘易感性相關(guān)粘附分子編碼基因的篩選與功能研究.pdf

1、目的：支氣管哮喘是一類復(fù)雜的炎癥性疾病，目前對(duì)哮喘的易感性機(jī)制知之甚少。本室前期研究顯示，當(dāng)損傷因子作用到一定程度，氣道上皮受到損傷，其結(jié)構(gòu)完整性遭到破壞以及其功能缺陷，導(dǎo)致局部氣道微環(huán)境失穩(wěn)態(tài)，可能是氣道高反應(yīng)性疾病的始動(dòng)因素。在氣道高反應(yīng)或氣道炎癥發(fā)生過程中，氣道上皮表達(dá)的粘附分子發(fā)揮重要的作用，氣道上皮細(xì)胞通過表達(dá)細(xì)胞間粘附分子-1(intercellularadhesionmolecule-1，ICAM-1)募集炎癥細(xì)胞，啟動(dòng)炎

2、癥反應(yīng)；通過其表達(dá)的整合素分子將上皮細(xì)胞錨定于基膜上，及通過鈣粘素維系細(xì)胞間的同源粘附，維持上皮的結(jié)構(gòu)和功能完整。因此，本研究假設(shè)粘附分子本身缺陷或表達(dá)失平衡與哮喘的易感性有關(guān)。為求證此假設(shè)，本研究①篩選了哮喘患者差異表達(dá)粘附分子，通過析因分析選擇了2個(gè)在哮喘患者中表達(dá)下調(diào)的粘附分子cateninalpha-like1、integrinbeta4，通過擴(kuò)增其5’調(diào)控區(qū)序列，進(jìn)行了序列變異分析；②觀察了cateninalpha-like1

3、、integrinbeta4在人支氣管上皮細(xì)胞(bronchialepithelialcells，HBECs)中的表達(dá)及對(duì)HBECs增殖和損傷修復(fù)的影響及機(jī)制，在細(xì)胞和分子水平探討哮喘的易感性機(jī)制。 方法：①提取哮喘患者外周血白細(xì)胞，抽提mRNA，逆轉(zhuǎn)錄，生物素-16-dUTP標(biāo)記，獲得cDNA探針，cDNA探針和人細(xì)胞外基質(zhì)與粘附分子基因芯片雜交，結(jié)果用軟件進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)，篩選差異表達(dá)粘附分子。②PCR擴(kuò)增哮喘患者表達(dá)下調(diào)的ca

4、teninalpha-like1、Integrinbeta4基因5’調(diào)控區(qū)，進(jìn)行正反雙向測序及序列變異分析。③原位雜交法觀察HBECs中cateninalpha-like1、integrinbeta4的表達(dá)。④建立HBECs損傷修復(fù)指數(shù)測定方法，觀察cateninalpha-like1、integrinbeta4反義寡核苷酸(antisenseoligonucleotide,ASO)對(duì)細(xì)胞損傷修復(fù)及增殖的影響。⑤觀察cateninalp

5、ha-like1、integrinbeta4在纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)n)啟動(dòng)的HBECs損傷修復(fù)及增殖中的作用。⑥用Westernblot技術(shù)檢測與細(xì)胞遷移活動(dòng)相關(guān)的粘附斑激酶(focaladhesionkinase,FAK)磷酸化，初步探討cateninalpha-like1、integrinbeta4參與上皮細(xì)胞修復(fù)活動(dòng)的機(jī)制。 結(jié)果：①哮喘易感性相關(guān)粘附分子表達(dá)譜研究：cDNA微陣列顯示哮喘患者組與正常人

6、組比較上調(diào)的粘附分子基因有15個(gè)，分別是Integrinalpha4、alphaL、alphaM、alphaV、beta1、beta8、NCAM1、P-selectin、FGB、THBS3、MMP24、TPA、Heparanase、PAI-1、PAI-2；下調(diào)的基因有integrinbeta4、cateninalpha-like1、VCAM、Vitronectin、uPA、TIMP-1共6個(gè)。析因分析顯示，integrinbeta4、c

7、ateninalpha-like1兩種分子的表達(dá)下調(diào)與哮喘易感性密切相關(guān)。②Cateninalpha-like1及integrinbeta4基因突變研究：在所有已測樣本的cateninalpha-like15’調(diào)控區(qū)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游902bp范圍內(nèi)未發(fā)現(xiàn)基因變異，尚不能證實(shí)cateninalpha-like1在哮喘患者表達(dá)下調(diào)與基因變異有關(guān)。Integrinbeta4序列分析發(fā)現(xiàn)，哮喘患者的-nt840、-nt839、-nt822、-n

8、t821由A突變?yōu)镃，提示哮喘患者5’調(diào)控區(qū)存在基因變異，該變異可能與基因的表達(dá)下調(diào)有關(guān)。③HBECs中cateninalpha-like1及integrinbeta4的表達(dá)：細(xì)胞爬片原位雜交觀察到未受臭氧應(yīng)激的HBECs中cateninalpha-like1陽性細(xì)胞數(shù)較少，而臭氧攻擊組較未受臭氧攻擊組，陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多。Integrinbeta4在未受臭氧應(yīng)激組有較明顯的雜交信號(hào)，臭氧攻擊后，陽性信號(hào)減弱，提示此兩種分子的表達(dá)參與H

9、BECs的應(yīng)激反應(yīng)應(yīng)答。④cateninalpha-like1ASO及integrinbeta4ASO對(duì)HBECs損傷修復(fù)及增殖的影響：結(jié)果顯示cateninalpha-like1ASO、integrinbeta4ASO明顯抑制HBECs的損傷修復(fù)及增殖。⑤cateninalpha-like1及integrinbeta4對(duì)Fn促HBECs損傷修復(fù)及增殖的介導(dǎo)作用觀察：檢測結(jié)果顯示，F(xiàn)n有較強(qiáng)的促損傷修復(fù)及促增殖能力，其效應(yīng)可被酪氨酸激酶

10、途徑抑制劑Genestin阻斷。Integrinbeta4ASO預(yù)處理可抑制Fn的促損傷修復(fù)，但對(duì)Fn促細(xì)胞增殖能力無明顯影響。Cateninalpha-like1ASO處理可抑制Fn的促損傷修復(fù)及促增殖效應(yīng)。⑥cateninalpha-like1及integrinbeta4表達(dá)對(duì)FAK磷酸化的影響：檢測結(jié)果顯示，F(xiàn)n可促進(jìn)FAK磷酸化，并在30分鐘達(dá)到高峰，F(xiàn)n的效應(yīng)可被Genestin阻斷，cateninalpha-like1可抑制

11、Fn的促FAK磷酸化效應(yīng)。 結(jié)論：哮喘患者組多個(gè)粘附分子的表達(dá)出現(xiàn)異常變化。哮喘病人integrinbeta45’調(diào)控區(qū)基因序列-nt840、-nt839、-nt822、-nt821存在變異，由A變異為C。HBECs可表達(dá)cateninalpha-like1及integrinbeta4，cateninalpha-like1及integrinbeta4促進(jìn)HBECs的損傷修復(fù)及增殖，并參與Fn促HBECs的損傷修復(fù)過程，但cate