高膽固醇和貝特類化合物分別通過LXR、PPARα增加大鼠膽汁酸的合成.pdf

1、目的：膽汁酸在肝中的合成是膽固醇排出體外的重要途徑。肝內(nèi)有“經(jīng)典(中性)”和“替代(酸性)”兩條膽汁酸合成途徑。膽固醇或通過經(jīng)典途徑在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)經(jīng)限速酶膽固醇7α-羥化酶(CYP7A1)的作用生成7α-羥膽固醇，或通過替代途徑在線粒體經(jīng)膽固醇27-羥化酶(CYP27A1)的作用生27-羥膽固醇，再經(jīng)3α-、12α-以及側(cè)鏈27-的羥化、連接輔酶A生成三羥(或二羥)膽甾烷?；o酶A(THC-CoA或DHC-CoA)后，進(jìn)入過氧化物酶體，側(cè)鏈經(jīng)

2、三羥基糞甾烷酰CoA氧化酶(Acox2)氧化脫氫、D-3-羥脂酰輔酶A脫水酶/D-3-羥脂酰輔酶A脫氫酶(D-雙功能蛋白，D-bifunctionalprotein，DBP)加水、再脫氫以及Scpx硫解酶的硫解，脫下一分子乙酰CoA，最終生成膽酸或鵝脫氧膽酸。位于肝微粒體的固醇12α-羥化酶(CYP8B1)催化鵝脫氧膽酸羥化生成膽酸，決定著膽酸和鵝脫氧膽酸的比例。 核受體LXR(liverXreceptor)被其天然配體氧化甾醇

3、或人工合成配體TO901317激活后，增加其下游基因CYP7A1mRNA表達(dá)，加速膽汁酸的合成。高膽固醇條件下可通過此途徑增加經(jīng)典途徑膽汁酸的合成，促進(jìn)膽固醇向體外排出。但此時(shí)替代途徑膽汁酸的合成有無變化?膽汁酸合成途徑中所涉及的Acox2和DBPmRNA表達(dá)是否隨膽汁酸合成增加而增加呢?未見報(bào)道。 過氧化物酶體增殖物激活受體α(PeroxisomeProliferatorActivatedReceptorα，PPARα)是核受

4、體超家族的一員，它被Fenofibrate等配體激活后，先與RXR(retinoidXrecptor)形成異二聚體，再作用到下游基因的順式元件上，激活與脂肪酸分解代謝有關(guān)的酶如過氧化物酶體棕櫚酰CoA氧化酶(Acox1)等的基因表達(dá)，調(diào)節(jié)脂肪酸的代謝。近年的研究結(jié)果表明，PPARα除了與脂肪酸的代謝有關(guān)外，也與膽固醇的代謝有關(guān)。PPARα可通過上調(diào)LXR和CYP8B1參與膽汁酸的合成。我們以前的實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，PPARα激活劑可以增加正常大

5、鼠肝臟CYP7A1和DBPmRNA的表達(dá)，增加膽汁酸的合成。高膽固醇條件下，大鼠的PPARα是否可通過調(diào)節(jié)與膽固醇側(cè)鏈氧化有關(guān)酶的基因表達(dá)而調(diào)控膽汁酸的合成?PPARα被激活后是否通過其下游基因LXR而引起與膽汁酸合成有關(guān)的酶蛋白基因表達(dá)增加，而調(diào)控膽汁酸的合成?未見報(bào)道。 在本試驗(yàn)中，我們用高膽固醇飲食造成大鼠高膽固醇血癥后，再給予PPARα的激活劑Fenofibrate，觀察血膽汁酸和糞膽汁酸的變化以及膽汁酸合成經(jīng)典途徑中關(guān)

6、鍵酶CYP7A1、替代途徑中CYP27A1mRNA的表達(dá)和CYP8B1、Acox2、DBPmRNA的表達(dá)的變化，探討在高膽固醇和激活了PPARα的條件下，膽汁酸合成代謝的哪些途徑發(fā)生了變化以及PPARα是否參與膽汁酸合成代謝的調(diào)節(jié)。 方法1動(dòng)物分組及取材將15只三月齡雄性SD大鼠，隨機(jī)分為兩組，一組為5只，給予普通飲食，為對照組(CON組)，；另一組為10只，給予高膽固醇飲食(含2％膽固醇，10％豬油)。在第13周，確認(rèn)血膽固醇

7、升至2.906±0.508mmol/L(普通飲食1.588±0.216mmol/L)后，換為普通飲食。原高膽固醇飲食組再隨機(jī)分為兩組，其中一組每天固定時(shí)間非諾貝特(Fenofibrate)灌胃(100mg/kg/day)，為Fenofibrate組(FENO組)；另一組為轉(zhuǎn)普通飲食組(CBD組)。對照組和轉(zhuǎn)普通飲食組每天給予非諾貝特的溶解劑灌胃。各組均自由食水。連續(xù)灌胃兩周后處死，于被處死前三天分籠飼養(yǎng)，每天上午9時(shí)收集糞便，用于糞膽汁

8、酸測定。大鼠禁食不禁水一晚，次日，頸動(dòng)脈插管收集血液，分離血清，用于血清膽汁酸測定；肝臟置液氮中，于-70℃保存，用于RNA提取。 2糞膽汁酸的提取大鼠糞便于80℃烘干，研成粉末。稱取50mg糞便粉末，加入3ml無水乙醇充分振蕩。70℃水浴15分鐘，邊水浴邊振蕩,3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，將上清移至另一管中。按上述方法用無水乙醇將沉淀重提兩次，合并上清。80℃水浴將上清中的乙醇蒸干。剩余物中加入3ml石油醚充分振蕩去除脂肪和中性

9、固醇，3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，棄上清。重復(fù)洗滌兩次后，往剩余沉淀中加入1ml含2％TritonX-100的乙醇，振蕩使沉淀充分溶解。80℃水浴蒸干乙醇，加入1ml蒸餾水溶解沉淀，即為提取的糞便總膽汁酸溶液。 3血清和糞膽汁酸的測定應(yīng)用美國生產(chǎn)的OlympusAu2700型全自動(dòng)生化分析儀，酶法測定膽汁酸。 4肝臟總RNA的提取用Trizol法提取。 5mRNA表達(dá)的測定β-actin作為內(nèi)參照，RT-PCR法測

10、定肝臟LXRmRNA、CYP7A1mRNA、DBPmRNA、CYP27A1mRNA、CYP8B1mRNA、AcoxlmRNA及Acox2mRNA的相對表達(dá)量。 結(jié)果1總膽汁酸水平的變化。大鼠總膽汁酸水平(μmol/L)以血膽汁酸和糞膽汁酸的量之和表示。Fenofibrate組總膽汁酸水平(277.814±27.307μmol/L)和轉(zhuǎn)正常組總膽汁酸水平(206.60±61.67μmol/L)都明顯高于對照組(91.274±12.

11、907μmol/L，P＜0.01)；Fenofibrate組總膽汁酸水平明顯高于轉(zhuǎn)正常組(P＜0.05)。 表明，高膽固醇增加了肝膽汁酸的合成，F(xiàn)enofibrate在高膽固醇的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步增加了膽汁酸的合成。 2肝Acox1mRNA相對表達(dá)量的改變。Fenofibrate組Acox1mRNA相對表達(dá)量(0.786±0.122，P＜0.01)明顯高于對照組(0.398±0.106)和轉(zhuǎn)正常組(0.422±0.082)；

12、轉(zhuǎn)正常組和對照組之間Acox1mRNA相對表達(dá)量無差別(P＞0.05)。 表明，F(xiàn)enofibrate激活了肝PPARα。 3肝LXRmRNA相對表達(dá)量的改變。Fenofibrate組LXRmRNA相對表達(dá)量(0.583±0.057，P＜0.01)和轉(zhuǎn)正常組LXRmRNA相對表達(dá)量(0.533±0.044，P＜0.05)都明顯高于對照組(0.357±0.117)；Fenofibrate組和轉(zhuǎn)正常組之間LXRmRNA相對表

13、達(dá)量無差別(P＞0.05)。 表明，LXRmRNA表達(dá)的增高與膽汁酸的合成增加有關(guān)，只與高膽固醇有關(guān)，而與PPARα的激活無關(guān)。 4肝CYP7A1mRNA相對表達(dá)量的改變。Fenofibrate組CYP7A1mRNA相對表達(dá)量(0.676±0.108)和轉(zhuǎn)正常組CYP7A1mRNA相對表達(dá)量(0.576±0.053)都明顯高于對照組(0.438±0.149，P＜0.05)；Fenofibrate組和轉(zhuǎn)正常組之間CYP7A

14、1mRNA相對表達(dá)量無差別(P＞0.05)。 表明，膽汁酸合成的增加與LXR的下游基因CYP7A1的表達(dá)增加及膽汁酸合成的經(jīng)典途徑有關(guān)。 5肝CYP27A1mRNA相對表達(dá)量的改變。Fenofibrate組(0.310±0.077)、轉(zhuǎn)正常組(0.286±0.051)以及對照組(0.336±0.051)三組之間CYP27A1mRNA相對表達(dá)量無差別(P＞0.05)。 表明，高膽固醇狀態(tài)下以及PPARα激活的狀態(tài)下

15、，膽汁酸合成的增加與膽汁酸替代合成途徑無關(guān)。 6肝CYP8B1mRNA相對表達(dá)量的改變。Fenofibrate組(0.809±0.152)、轉(zhuǎn)正常組(0.736±0.164)以及對照組(0.697±0.133)三組之間CYP8B1mRNA相對表達(dá)量無差別(P＞0.05)。 表明，高膽固醇狀態(tài)下以及PPARα激活狀態(tài)下，膽酸的合成水平以及膽汁酸中膽酸與鵝脫氧膽酸的比例無變化。 7肝Acox2mRNA相對表達(dá)量的改變

16、。Fenofibrate組(0.512±0.116)、轉(zhuǎn)正常組(0.518±0.083)以及對照組(0.707±0.116)三組之間Acox2mRNA相對表達(dá)量無差別(P＞0.05)。 表明，高膽固醇狀態(tài)下以及PPARα激活狀態(tài)下，膽汁酸合成的增加與膽汁酸合成過程中催化膽固醇側(cè)鏈β-氧化的第一個(gè)酶Acox2mRNA表達(dá)量無關(guān)。 8肝DBPmRNA相對表達(dá)量的改變。Fenofibrate組DBPmRNA相對表達(dá)量(0.64

17、3±0.172，p＜0.05)明顯高于對照組(0.397±0.059)和轉(zhuǎn)正常組(0.432±0.053)；轉(zhuǎn)正常組和對照組之間DBPmRNA相對表達(dá)量無差別(p＞0.05)。 表明，高膽固醇引起膽汁酸的合成增加與DBPmRNA表達(dá)量增加無關(guān)，而Fenofibrate增加的膽汁酸的合成與DBPmRNA表達(dá)量增加有關(guān)。 結(jié)論1高膽固醇時(shí)，大鼠肝經(jīng)LXR激活CYP7A1mRNA的表達(dá)，加速經(jīng)典途徑而非替代途徑膽汁酸的合成，增