低頻低功率超聲誘導(dǎo)C-,6-膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的初步研究.pdf

1、目的：探討低頻低功率超聲誘導(dǎo)大鼠C<,6>膠質(zhì)瘤細(xì)胞(簡(jiǎn)稱：C<,6>細(xì)胞，下同)凋亡，及其在誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制。 方法： 采用MTT比色法、A0/EB雙染色法、TUNEL、流式細(xì)胞儀、電鏡技術(shù)等技術(shù)分析不同功率的低頻超聲誘導(dǎo)C<,6>細(xì)胞凋亡的作用。 (1)MTT比色法檢測(cè)不同功率的低頻超聲作用C<,6>細(xì)胞后Oh、6h、12h、24h和48h等時(shí)間點(diǎn)的OD值，計(jì)算生長(zhǎng)抑制率，初步確定下一步實(shí)驗(yàn)所需

2、超聲參數(shù)； (2)AO/EB雙染色法鑒別對(duì)照組和輻照各組凋亡/壞死/活C<,6>細(xì)胞，并計(jì)算細(xì)胞凋亡率和壞死率，最終確定實(shí)驗(yàn)所需超聲參數(shù)； (3)TUNEL 法觀察對(duì)照組和輻照組C<,6>細(xì)胞的免疫學(xué)變化，并計(jì)算凋亡指數(shù)； (4)流式細(xì)胞儀分析對(duì)照組和輻照組C<,6>細(xì)胞的凋亡率(FITC-Annexin V/PI雙染法)，細(xì)胞周期及APR改變(PI單染法)； (5)透射及掃描電鏡觀察對(duì)照組和輻照組C<,

3、6>細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。 結(jié)果： (1)MTT比色法分析可見不同功率低頻超聲輻照C<,6>細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖均受到抑制，且呈劑量依賴性；由超聲輻照后0h、6h、12h、24h、48h時(shí)間點(diǎn)的IR值可見：1.75W/cm<'2>組、2.0W/cm<'2>組、2.5W/cm<'2>組輻照后6h對(duì)C<,6>細(xì)胞增殖抑制作用明顯，以下實(shí)驗(yàn)均采用超聲輻照后6h作為觀察點(diǎn)。 (2)AO/EB雙染色法分析可見對(duì)照組僅有極

4、少數(shù)早期凋亡細(xì)胞，而輻照后各組凋亡細(xì)胞明顯增加。1.75W/cm<'2>組、2.0w/cm<'2>組、2.5W/cm<'2>組細(xì)胞凋亡率分別為17.9±0.65％、13.4±0.94％和12.5±0.67％，細(xì)胞壞死率分別為1.3±0.61％、8±0.54％和20±0.63％； (3)TUNEL法分析可見對(duì)照組僅有極少量棕黃色染色的凋亡細(xì)胞。而輻照組棕黃色染色的凋亡細(xì)胞明顯增多。與對(duì)照組相比較，輻照組的凋亡指數(shù)(AI)極顯著增加

5、(P<0.01)。 (4)流式細(xì)胞儀分析可見：與對(duì)照組相比較，輻照組的細(xì)胞凋亡率增加極顯著(P<0.01)；對(duì)照組細(xì)胞在正常二倍體DNA峰前未出現(xiàn)亞二倍體凋亡峰(Ap峰，Apoptotic peak)，輻照組細(xì)胞則出現(xiàn)一明顯的亞二倍體凋亡峰；與對(duì)照組相比較，輻照組細(xì)胞的凋亡增殖比(APR)極顯著上調(diào)(P<0.01)。 (5)透射及掃描電鏡觀察可見：透射電鏡未見到對(duì)照組C<,6>細(xì)胞凋亡的超微結(jié)構(gòu)改變，而輻照組C<,6>細(xì)

6、胞可見到凋亡各階段的改變，并可見典型的凋亡小體；掃描電鏡顯示對(duì)照組C<,6>細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞邊界清楚。輻照組C<,6>細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞膜有穿孔現(xiàn)象。 結(jié)論： 低頻低功率超聲輻照能抑制C<,6>細(xì)胞增殖，并具有劑量依賴性； 1.75W/cm<'2>的超聲輻照C<,6>細(xì)胞后繼續(xù)培養(yǎng)6h可獲得最高的凋亡率和最低的壞死率，是超聲誘導(dǎo)C<,6>細(xì)胞凋亡的最佳參數(shù)，當(dāng)輻照功率繼續(xù)增加時(shí)，細(xì)胞凋亡率未繼續(xù)增加，而