趨化因子SDF-1和MCP-1在心肌梗死后骨髓間質(zhì)干細(xì)胞歸巢中作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分：MI大鼠心肌組織中SDF—1與MCP—1的動(dòng)態(tài)變化及意義 目的： 有研究提示移植后的骨髓干細(xì)胞可以植入到心肌梗死周圍區(qū)域中，而細(xì)胞因子單核細(xì)胞趨化蛋白—1（monocyte chemotactic protein1，MCP—1）及基質(zhì)細(xì)胞衍生因子—1（stromal cell—derived factor1，SDF—1）可能對(duì)干細(xì)胞具有趨化作用。移植干細(xì)胞植入到心肌梗死和／或周圍區(qū)域的現(xiàn)象是否與心肌梗死后細(xì)胞因

2、子水平和分布存在聯(lián)系尚不十分明確。本研究結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支建立心肌梗死（myocardial infarction，MI）模型，探討MI后心肌組織中不同部位和不同時(shí)段細(xì)胞因子MCP—1及SDF—1表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化及其意義。 方法： 以原位雜交及免疫組化方法檢測(cè)大鼠心肌梗死前及梗死后1、2、4、7、14、28、56天梗死中心區(qū)域、梗死周圍區(qū)域及無(wú)梗死正常區(qū)域SDF—1、MCP—1 mRNA及其蛋白的表達(dá)情況；同時(shí)建立單

3、純開(kāi)胸假手術(shù)對(duì)照組，于術(shù)后1、2、4、7、14、28、56d以同樣方法檢測(cè)SDF—1、MCP—1 mRNA及蛋白的表達(dá)情況。 結(jié)果： 心肌梗死大鼠中：梗死中心區(qū)域MCP—1于心肌梗死后第1d升高，第2d達(dá)峰值，至第14d漸降至正常水平；梗死周圍區(qū)域MCP—1心肌梗死后第1天升高，7天達(dá)峰值，至第28天恢復(fù)正常水平；梗死中心區(qū)域及周圍區(qū)域SDF—1均于心肌梗死后第1天升高并達(dá)峰值，至第14天漸恢復(fù)至正常水平；無(wú)梗死正常區(qū)域

4、中MCP—1、SDF—1的表達(dá)在正常水平，且不隨時(shí)間改變而改變。假手術(shù)非梗死組大鼠心肌中MCP—1、SDF—1的表達(dá)在正常水平，且不隨時(shí)間改變而改變。MCP—1、SDF—1 mRNA與蛋白的表達(dá)變化趨勢(shì)相一致。 結(jié)論： 心肌梗死后早期梗死中心及周圍區(qū)域SDF—1、MCP—1表達(dá)水平升高；根據(jù)梗死中心區(qū)和周圍區(qū)域細(xì)胞因子SDF—1、MCP—1表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化情況選擇治療時(shí)間窗，可能有助于趨化更多的干細(xì)胞到達(dá)損傷部位，提高治療

5、效果，可能對(duì)心肌梗死后組織修復(fù)產(chǎn)生影響。 第二部分：SDF—1與MCP—1對(duì)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞歸巢到急性梗死心肌中作用的研究 目的： 心肌梗死后早期，SDF—1、MCP—1表達(dá)迅速升高，并對(duì)MSCs的歸巢起到了重要的促進(jìn)作用。但內(nèi)源性的SDF—1、MCP—1表達(dá)時(shí)段短、表達(dá)水平低，與心肌梗死后超急性期炎癥反應(yīng)的時(shí)間窗重疊，可使趨化作用受到限制。本研究通過(guò)外源性的SDF—1、MCP—1進(jìn)行干預(yù)，探討外源性SDF—1與M

6、CP—1在骨髓間質(zhì)干細(xì)胞歸巢到急性梗死心肌中的作用。 方法： 細(xì)胞培養(yǎng)采用健康F344大鼠麻醉后取雙下肢股骨后處死，股骨移入超凈臺(tái)內(nèi)，咬骨鉗咬碎股骨，以IMDM培養(yǎng)基沖洗髓腔獲取骨髓干細(xì)胞。采用全骨髓培養(yǎng)法培養(yǎng)擴(kuò)增，利用MSCs貼附于塑料培養(yǎng)皿的特點(diǎn)，在傳代增殖過(guò)程中通過(guò)換液逐漸去除造血系細(xì)胞等雜質(zhì)細(xì)胞。經(jīng)21～28天培養(yǎng)，約傳代3～4代的細(xì)胞即可用于移植。細(xì)胞移植前予以含10μmol/L BrdU的培養(yǎng)基孵育24小時(shí)進(jìn)

7、行細(xì)胞標(biāo)記。 近交系F344大鼠隨機(jī)分為5組，其中4組為心肌梗死大鼠，1組為正常大鼠。大鼠心肌梗死模型建立前行超聲心動(dòng)圖檢查心功能（left ventricular ejection fraction，LVEF；left ventricular fractional shortening，LVFS）。心肌梗死大鼠于梗死4天后行超聲心動(dòng)圖檢查心功能，然后3組梗死大鼠在心肌梗死區(qū)及其周圍注射外源性MCP—1、SDF—1、MCP—1+

8、SDF—1進(jìn)行干預(yù)，剩余1組梗死大鼠于相應(yīng)部位注射等量的生理鹽水進(jìn)行對(duì)照，正常大鼠也于相應(yīng)部位注射等量的生理鹽水進(jìn)行對(duì)照。隨后所有大鼠經(jīng)尾靜脈注射BrdU標(biāo)記的MSCs（5×106），MSCs移植3天后處死一半大鼠檢測(cè)心肌梗死區(qū)MSCs的歸巢量，28天后剩余一半大鼠檢測(cè)大鼠心功能狀況后處死，取出心臟檢測(cè)心肌梗死區(qū)及其周圍血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達(dá)和新生血管密度

9、。 結(jié)果： 心肌梗死組MSCs歸巢量大于正常大鼠對(duì)照組。MCP—1、SDF—1、MCP—1+SDF—1處理組大鼠心肌梗死區(qū)MSCs歸巢量、新生毛細(xì)血管密度明顯優(yōu)于對(duì)照組。MCP—1+SDF—1處理組大鼠心肌梗死區(qū)MSCs歸巢量及新生毛細(xì)血管密度大于MCP—1、SDF—1處理組，但三組間MSCs移植后心功能水平無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)論： SDF—1、MCP—1能夠促進(jìn)MSCs歸巢并改善心功能，促進(jìn)毛細(xì)血管

10、增生可能為其改善心功能的機(jī)制之一；SDF—1、MCP—1聯(lián)合使用較單用更有效，但尚未達(dá)到兩者的相加作用。其原因可能與炎癥損傷干細(xì)胞、受體重疊、內(nèi)陷等有關(guān)，尚需進(jìn)一步研究明確其具體原因；以獲得更佳的治療效果。 第三部分：SDF—1、MCP—1對(duì)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞歸巢劑量—效應(yīng)關(guān)系的研究 目的： 外源性細(xì)胞因子SDF—1和MCP—1可以促進(jìn)MSCs歸巢，但歸巢量與細(xì)胞因子的水平是否存在聯(lián)系還有待探討。本研究探討SDF—1

11、、MCP—1在骨髓間質(zhì)干細(xì)胞歸巢到梗死心肌中的劑量—效應(yīng)關(guān)系及二者之間是否存在協(xié)同效應(yīng)。 方法： 大鼠于心肌梗死模型建立前、MSCs移植前及移植后28天行超聲心動(dòng)圖檢查心功能（LVEF；LVFS）。大鼠共分為12組，5組大鼠心肌梗死56天后于心肌梗死區(qū)及其周圍分別均勻注射不同濃度（50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml、800ng/ml）的MCP—150μl，5組大鼠心肌梗死56天后于心肌梗

12、死區(qū)及其周圍分別均勻注射不同濃度（50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml、800ng/ml）的SDF—150μl，1組大鼠心肌梗死56天后于心肌梗死區(qū)及其周圍均勻注射200ng/ml MCP—1+200ng/ml SDF—1各50μl，1組大鼠心肌梗死56天后于心肌梗死區(qū)及其周圍均勻注射等量的生理鹽水進(jìn)行對(duì)照。然后各組大鼠經(jīng)尾靜脈注射BrdU標(biāo)記的MSCs（5×106），MSCs移植3天后各組處死一半大鼠檢

13、測(cè)梗死區(qū)及其周圍MSCs的歸巢量，28天后檢測(cè)剩余一半大鼠心功能狀況、以及梗死區(qū)及其周圍VEGF的表達(dá)及新生血管密度。 結(jié)果： MCP—1、SDF—1注射組MSCs歸巢量大于生理鹽水對(duì)照組；且隨著MCP—1、SDF—1劑量的增加，MSCs歸巢量亦相應(yīng)增加，呈線性關(guān)系。VEGF的表達(dá)及新生血管密度與MSCs歸巢量相一致。SDF—1與MCP—1聯(lián)合注射組MSCs歸巢量、新生毛細(xì)血管數(shù)高于同劑量的單純SDF—1或MCP—1注

14、射組。各組大鼠心功能較MSCs移植前改善，但各組之間無(wú)顯著差異。 結(jié)論： 心肌梗死56天后無(wú)明顯MSCs自發(fā)歸巢。SDF—1、MCP—1能夠促進(jìn)MSCs歸巢，歸巢的MSCs可能通過(guò)分泌VEGF而促進(jìn)血管新生；而且MSCs的歸巢量與SDF—1、MCP—1的劑量呈線性劑量—效應(yīng)關(guān)系。但對(duì)改善心功能無(wú)明顯作用，可能與大鼠梗死后干預(yù)時(shí)間過(guò)晚有關(guān)。SDF—1、MCP—1聯(lián)合使用較單用更有效，但尚未達(dá)到兩者的相加作用。 第四

15、部分：MCP—1與SDF—1在G—CSF外周動(dòng)員自身骨髓干細(xì)胞歸巢中作用的研究 目的： G—CSF能夠動(dòng)員骨髓干細(xì)胞進(jìn)入外周血液循環(huán)，但外源性SDF—1、MCP—1對(duì)G—CSF動(dòng)員釋放的骨髓干細(xì)胞的歸巢是否有促進(jìn)作用還不十分清楚。本部分研究探討細(xì)胞因子MCP—1與SDF—1在G—CSF動(dòng)員自身骨髓干細(xì)胞歸巢治療缺血性心臟病中的作用。 方法： 心肌梗死模型制作成功8周后，所有大鼠給予皮下注射瑞白（重組人粒

16、細(xì)胞集落刺激因子，rhG—CSF）20μg·kg—1·d—1，共5天。隨后予以超聲心動(dòng)圖檢查心功能（EF、FS），再將大鼠隨機(jī)分為3組，每組15只，一組為SDF—1注射組，一組為MCP—1注射組，一組為生理鹽水對(duì)照組。SDF—1及MCP—1注射組大鼠于心肌梗死區(qū)及其周圍5個(gè)區(qū)域均勻注射SDF—1及MCP—1400ng/ml各10μl，對(duì)照組于相應(yīng)區(qū)域注射生理鹽水各10μl。接著每只大鼠腹腔注射BrdU50mg·kg—1·d—1，共15天

17、。細(xì)胞因子注射4周（心肌梗死后12周+5天）以后超聲心動(dòng)圖檢查心功能后戊巴比妥鈉（50mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠后，經(jīng)主動(dòng)脈注入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的氯化鉀2ml，使心臟停搏于舒張期。隨即開(kāi)胸取出大鼠心臟，進(jìn)行CD45、CD90、BrdU、VEGF及Ⅷ因子免疫組化染色。 結(jié)果： MCP—1、SDF—1注射組與生理鹽水對(duì)照組相比，梗死區(qū)域BrdU、CD45、CD90陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多，VEGF表達(dá)及毛細(xì)血管數(shù)明顯增加。MCP