巨噬細(xì)胞和苯妥英鈉中介的旁分泌機(jī)制在心肌梗死后組織修復(fù)中的作用.pdf

1、心肌梗死后組織修復(fù)過程是影響心室重塑發(fā)展方向的決定因素。近年來的研究顯示，苯妥英鈉(PHT)可以通過介導(dǎo)旁分泌機(jī)制加速創(chuàng)傷修復(fù)，我們實(shí)驗(yàn)室的前期工作證實(shí)苯妥英鈉可加速心肌梗死后組織修復(fù)，其可能機(jī)制是通過激活巨噬細(xì)胞，中介旁分泌機(jī)制。巨噬細(xì)胞在組織修復(fù)中是各種細(xì)胞因子和生長因子的重要來源。心肌梗死后早期移植巨噬細(xì)胞可促進(jìn)血管新生、組織修復(fù)，改善心室重塑和心臟功能。然而苯妥英鈉通過激活巨噬細(xì)胞促進(jìn)心肌梗死后組織修復(fù)的具體機(jī)制尚不十分清楚。

2、 目的：本實(shí)驗(yàn)建立Wistar大鼠心肌缺血再灌注模型，并在梗死后早期進(jìn)行同種異體腹腔巨噬細(xì)胞心肌內(nèi)移植，和PHT預(yù)刺激的腹腔巨噬細(xì)胞心肌內(nèi)移植，以及梗死后14天持續(xù)給予PHT腹腔內(nèi)注射，觀察上述干預(yù)因素對(duì)組織病理學(xué)、分子生物學(xué)和血流動(dòng)力學(xué)的綜合影響，旨在探討巨噬細(xì)胞和PHT介導(dǎo)的旁分泌機(jī)制對(duì)心肌梗死后組織修復(fù)和心室重塑過程的影響并探討其可能機(jī)制。 方法：1．細(xì)胞實(shí)驗(yàn)部分：進(jìn)行Wistar大鼠腹腔巨噬細(xì)胞原代培養(yǎng)，并以苯妥英

3、鈉對(duì)部分體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞進(jìn)行預(yù)刺激(24h)，移植前用熒光染料DAPI標(biāo)記。 2．動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分：建立Wistar大鼠心肌缺血再灌注模型，成活動(dòng)物隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組，12只)，對(duì)照組 (AMI組，23只)，苯妥英鈉組(PHT組，17只)，單純巨噬細(xì)胞移植組(Mφ組，20只)，以及經(jīng)苯妥英鈉預(yù)刺激的巨噬細(xì)胞移植組(Mφ-PHT組，16只)。Mφ組和Mφ-PHT組在再灌注同時(shí)，向左心室缺血區(qū)中心及周邊分別以1×10<'5>

4、細(xì)胞/只，100μL的劑量多點(diǎn)注射；AMI組和PHT組注射不完全DMEM培養(yǎng)基(100μL)；PHT組從術(shù)后第1天開始，連續(xù)14天經(jīng)腹腔注射PHT(75mg/kg/天)。術(shù)后第7天，各組分別隨機(jī)處死部分動(dòng)物，留取心臟標(biāo)本，稱量雙側(cè)心室重量；通過苦味酸-天狼猩紅染色測(cè)定膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)及膨展指數(shù)、梗死面積等，結(jié)合環(huán)形偏振光分析梗死區(qū)膠原成分比例；抗α-SMA免疫熒光染色測(cè)定梗死區(qū)小動(dòng)脈密度；抗vWF免疫熒光染色測(cè)定梗死區(qū)毛細(xì)血管密度

5、；抗WGA免疫熒光染色測(cè)定非梗死區(qū)心肌細(xì)胞橫截面積(CSA)；梗死區(qū)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、金屬蛋白酶組織抑制劑-1(TIMP-1)、金屬蛋白酶組織抑制劑-2(TIMP-2) 蛋白表達(dá)水平采用Western blot分析。剩余動(dòng)物于模型建立后第28天進(jìn)行有創(chuàng)血流動(dòng)力學(xué)分析，而后處死動(dòng)物取心臟組織，進(jìn)行組織病理學(xué)分析。 結(jié)果：1．細(xì)胞實(shí)驗(yàn)部分：1)體外培養(yǎng)

6、的巨噬細(xì)胞貼壁牛長，培養(yǎng)的細(xì)胞群中無分裂相；苯妥英鈉刺激后的巨噬細(xì)胞仍貼壁良好，生長狀況穩(wěn)定；2)貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞群中絕大多數(shù)細(xì)胞呈CD68 陽性。3) DAPI 標(biāo)記的巨噬細(xì)胞，經(jīng)紫外光激發(fā)后呈現(xiàn)大量圓形或不規(guī)則型的藍(lán)色熒光。 2．動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分：1)巨噬細(xì)胞移植成功的證據(jù)：術(shù)后1天心肌梗死區(qū)組織CD68免疫熒光染色顯示DAPI標(biāo)記的巨噬細(xì)胞表達(dá)CD68。2)術(shù)后第28天血流動(dòng)力學(xué)結(jié)果：Mφ-PHT 組術(shù)后第 28 天LV+dp/

7、dt<,max>顯著高于AMI組；與Mφ組比較，Mφ-PHT組術(shù)后第28天LV+dp/dt<,max>亦增高且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。3)心臟重量指標(biāo)比較：全心室體重比(V/BW)、左室體重比(LV/BW)、右室體重比(RV/BW)在各組間比較無顯著差異。4)左室重塑指標(biāo)結(jié)果：與AMI組比較，PHT組、Mφ組和 Mφ-PHT 組術(shù)后第7天和第28天膨展指數(shù)均顯著減少且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與AMI組比較，Mφ-PHT組術(shù)后第28天梗死面積顯著減?。慌c

8、AMI組比較，PHT組術(shù)后7天和第28天梗死面積有減小趨勢(shì)；與Mφ組比較，Mφ-PHT 組術(shù)后7天和第28天梗死面積有減小趨勢(shì)；與AMI組比較，Mφ組和Mφ-PHT 組術(shù)后7 天纖維面積顯著減??；與AMI組比較，PHT組、Mφ組和Mφ-PHT 組術(shù)后第28天纖維面積顯著減小；與Mφ組比較，Mφ-PHT 組術(shù)后第28天纖維面積顯著減??；與AMI組比較，Mφ組和 Mφ-PHT 組術(shù)后7天非梗死區(qū)CSA顯著減小，而PHT組術(shù)后7天非梗死區(qū)CS

9、A 有減小趨勢(shì)；與AMI組比較，PHT組、Mφ組和Mφ-PHT組術(shù)后第28天非梗死區(qū)CSA顯著減小。5) 膠原容積分?jǐn)?shù)結(jié)果：與AMI組比較，PHT組、Mφ組利Mφ-PHT組術(shù)后第7天和第28天梗死區(qū)CVF顯著增加；與Mφ組比較，Mφ-PHT組術(shù)后第7天梗死區(qū)CVF顯著增加；與AMI組比較，Mφ組和Mφ-PHT組術(shù)后第7天和第28天非梗死區(qū)CVF顯著減少。6)膠原成分比例結(jié)果：與AMI組比較，PHT組、Mφ組和Mφ-PHT組術(shù)后第7天和第

10、28天梗死區(qū)膠原成熟度顯著增加；與Mφ組比較，Mφ-PHT 組術(shù)后第7天和第28天梗死區(qū)膠原成熟度顯著增加。7)小動(dòng)脈密度分析結(jié)果：與AMI組比較，PHT 組、Mφ組和Mφ-PHT 組術(shù)后第7天和第28天小動(dòng)脈密度顯著增加：與Mφ組比較，Mφ-PHT組術(shù)后第7天和第28天小動(dòng)脈密度有增加趨勢(shì)。8)毛細(xì)血管密度分析結(jié)果：與AMI 組比較，PHT組術(shù)后第7天和第28天毛細(xì)血管密度有增加趨勢(shì)；與Mφ組比較，Mφ-PHT組術(shù)后第7天和第28天毛

11、細(xì)血管密度有增加趨勢(shì)。9)Westernblot 檢測(cè)結(jié)果：與AMI 組比較，Mφ-PHT 組術(shù)后第7天梗死區(qū) b-FGF、MMP-2、TIMP-1和 TIMP-2 蛋白表達(dá)水平顯著增強(qiáng)；與AMI組比較，PHT組和Mφ組術(shù)后第7天梗死區(qū)MMP-2蛋白表達(dá)水平顯著降低；與Mφ組比較，Mφ-PHT組術(shù)后第7天梗死區(qū) VEGF、b-FGF、MMP-2、TIMP-1和TlMP-2蛋白表達(dá)水平顯著增強(qiáng)：與Sham組比較，AMI組術(shù)后第7天梗死區(qū)M

12、MP-2/TIMP-2比值顯著增加。 結(jié)論：1．苯妥英鈉可能通過介導(dǎo)旁分泌機(jī)制，加速膠原沉積和成熟，并促進(jìn)小動(dòng)脈形成，加速組織修復(fù)過程，繼而改善心肌梗死后心室重塑；2．心肌梗死區(qū)巨噬細(xì)胞移植亦可通過上述機(jī)制加速組織修復(fù)、改善心肌梗死后心室重塑；3．苯妥英鈉預(yù)刺激的巨噬絀胞可以對(duì)心肌梗死后組織修復(fù)過程產(chǎn)生明顯的協(xié)同作用，可能機(jī)制為通過旁分泌效應(yīng)上調(diào)多種與組織修復(fù)密切相關(guān)的生長因子/關(guān)鍵酶系的蛋白表達(dá)水平，加速組織修復(fù)過程，且改善左