不同序列型ail基因克隆菌株的構(gòu)建及其粘附侵襲性分析.pdf

1、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌廣泛分布于自然界,是能在冷藏溫度下生長的少數(shù)腸道致病菌之一,主要經(jīng)消化道傳播,是一種重要的食源性致病菌,很多國家都已將其列為進(jìn)出口食品的常規(guī)檢測項(xiàng)目。小腸結(jié)腸炎耶爾森菌對人類和動物具有明顯的致病性,感染后可表現(xiàn)為一系列不同癥狀,除能引起胃腸道癥狀外,還能引起呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、骨骼結(jié)締組織等局部組織和全身的疾患,甚至可引起敗血癥,造成死亡。
　　 致病性細(xì)菌的共同特征就是突破宿主的防御機(jī)制,與細(xì)菌生存特征(細(xì)

2、胞外生存或細(xì)胞內(nèi)寄生)密切相關(guān)。致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌是一種兼性細(xì)胞內(nèi)致病菌,粘附侵襲性是其毒力機(jī)制的重要特征,介導(dǎo)粘附侵襲相關(guān)功能的ail基因被認(rèn)為是其毒力機(jī)制的一個重要因素。目前可將國內(nèi)外已獲得的致病菌株的ail基因分為3種類型:高致病株(1b/O:8)來源的A2型;低致病株來源的A1型;新發(fā)現(xiàn)序列A3型。
　　 小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的粘附侵襲機(jī)制非常復(fù)雜,是多種已知和未知因素綜合作用的結(jié)果,一旦某種因素發(fā)生改變,就有可能引

3、起其功能表型的相應(yīng)改變,因而粘附侵襲位點(diǎn)基因(ail)的核酸序列出現(xiàn)改變時,就有可能會引起其粘附侵襲表型的改變。
　　 目的:
　　 1.構(gòu)建不同序列型ail基因的重組克隆菌株。
　　 2.利用體外組織細(xì)胞粘附侵襲實(shí)驗(yàn)探索ail基因序列多態(tài)性可能會引起的Ail蛋白功能的改變及其與不同生物血清型菌株間致病性差異的關(guān)系。
　　 3.初步分析代表新序列型ail基因的IE419菌株在粘附侵襲功能及細(xì)菌毒力方面是否

4、出現(xiàn)改變。
　　 方法:
　　 1.選擇分別代表3種不同序列型ail基因的致病性耶爾森菌,通過PCR擴(kuò)增獲得基因序列后,構(gòu)建pMD18-T-ail重組質(zhì)粒,分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109和非致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌Y40。挑選克隆菌株進(jìn)行特異性PCR和測序鑒定。
　　 2.用經(jīng)鑒定正確連接的陽性克隆菌株,對Hep-2細(xì)胞和HT-29細(xì)胞做體外粘附侵襲實(shí)驗(yàn)。計(jì)算各個克隆菌株的粘附侵襲效率,篩選粘附侵襲表型陽性克隆菌株,

5、并比較不同序列型克隆菌株在粘附侵襲功能上是否存在差異,尤其關(guān)注新發(fā)現(xiàn)A3序列型ail基因粘附侵襲功能的改變。
　　 結(jié)果:
　　 1.經(jīng)PCR擴(kuò)增、測序鑒定,成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-T-ail,轉(zhuǎn)化得到重組菌株JM109/pMD18-T-ail和Y40/pMD18-T-ail。
　　 2.RT-PCR結(jié)果顯示,不同序列型ail基因在各種克隆菌株中成功轉(zhuǎn)錄。
　　 3.體外粘附侵襲實(shí)驗(yàn)顯示,對小鼠高致病

6、株Ye9201O(1b/O:8)代表的A2型大腸桿菌克隆菌株能夠穩(wěn)定表達(dá)粘附侵襲功能,而對小鼠低致病株HA8629(2/O:9)代表的A1型大腸桿菌克隆菌株和IE419(2/0:9)代表的新發(fā)現(xiàn)A3型大腸桿菌克隆菌株均只有1株顯示粘附侵襲功能;3種類型大腸桿菌克隆菌株對兩種組織細(xì)胞的粘附侵襲作用無系別差異。
　　 4.顯微鏡下觀察3種粘附侵襲陽性的大腸桿菌克隆菌株與HEp-2細(xì)胞作用后的染色圖片,結(jié)果顯示:與致病性小腸結(jié)腸炎耶爾

7、森菌相比,克隆菌株沿細(xì)胞排列的形態(tài)出現(xiàn)改變,呈點(diǎn)狀、散在分布。
　　 5.3種類型非致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌ail基因克隆菌株均不表現(xiàn)粘附侵襲的功能,并且在獲得ail基因后,其本身固有的非特異性粘附效率出現(xiàn)了下降。
　　 結(jié)論:
　　 1.成功構(gòu)建不同序列型ail基因的大腸桿菌克隆菌株和非致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌克隆菌株。
　　 2.通過體外粘附侵襲實(shí)驗(yàn)獲得含不同序列型ail基因且粘附侵襲表型陽性的大腸桿