垂體腺瘤中NPY、miR-15a-miR-16和Bcl-2相關(guān)性研究.pdf

1、目的：本實驗旨在進一步研究無功能垂體腺瘤細胞（αT3細胞）中 NPY、miR-15a/miR-16和Bcl-2之間的相互關(guān)系，及NPY、miR-15a/miR-16、Bcl-2各自在96 h內(nèi)的變化規(guī)律，同時觀察無功能垂體腺瘤細胞增殖和細胞周期變化。以期探討 NPY、miR-15a/miR-16和 Bcl-2之間的相互關(guān)系及其對無功能垂體腺瘤細胞發(fā)生、發(fā)展的影響。進而深入了解NPY在垂體腺瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用，從另一視角探討垂體腺瘤的發(fā)

2、病機制，或許對現(xiàn)有理論進行補充，為垂體腺瘤的基因治療增加新的實驗數(shù)據(jù)。
　　內(nèi)容：本實驗對αT3細胞進行分組培養(yǎng)，各組給予不同干預措施，觀察各組（Ⅰ~Ⅸ）αT3細胞中各時間點NPY、miR-15a/miR-16和Bcl-2在基因和蛋白水平的表達情況，以及各組（Ⅰ~Ⅲ，Ⅷ、Ⅸ）各時間點細胞周期和細胞增殖活性的相應改變。最后對各組實驗結(jié)果和數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析比較，得出結(jié)論。
　　方法：
　　1.細胞來源：無功能垂體腺瘤細胞

3、系（αT3細胞）由北京協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)外科實驗室提供。
　　2.實驗分組：Ⅰ空白對照組；Ⅱ NPY增強劑組；Ⅲ NPY拮抗劑組；Ⅳ化學合成針對miR-15a反義核酸分子轉(zhuǎn)染垂體瘤細胞組；Ⅴ攜帶miR-15a脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染垂體瘤細胞組；Ⅵ化學合成針對 miR-16反義核酸分子轉(zhuǎn)染垂體瘤細胞組；Ⅶ攜帶miR-16脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染垂體瘤細胞組；Ⅷ NPY增強劑和攜帶miR-15a脂質(zhì)體干預組；Ⅸ NPY增強劑和攜帶miR-16脂質(zhì)體干預組。
　

4、　3.各組分別在0 h、24 h、48 h、72 h、96 h應用RTFQ-PCR和Western Blot檢測NPY mRNA、miR-15a、miR-16、Bcl-2 mRNA和NPY、Bcl-2等六項指標的表達，分析各指標變化趨勢、變化特點及相互之間的關(guān)系，并進行統(tǒng)計學分析。
　　4.于0 h、48 h、72 h、96 h對Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅷ、Ⅸ組分別應用流式細胞儀檢測細胞周期，MTT法檢測細胞增殖活性，分別觀察與NPY和Bcl

5、-2之間的關(guān)系，并進行統(tǒng)計學分析。
　　結(jié)果：
　　1.NPY增強劑/拮抗劑干預后，NPY mRNA、NPY與Bcl-2 mRNA、Bcl-2表達均較空白對照組升高/降低，各組中 NPY與 Bcl-2呈同向表達趨勢。NPY與miR-15a/miR-16呈負向表達。
　　2.上調(diào)miR-15a/miR-16后，NPY mRNA、NPY和Bcl-2 mRNA、Bcl-2表達較空白對照組降低或無明顯變化，整體上miR-15a

6、/miR-16與Bcl-2 mRNA、Bcl-2呈負向表達。
　　3.下調(diào)miR-15a/miR-16后，NPY mRNA、NPY和Bcl-2 mRNA、Bcl-2表達較空白對照組增高或無明顯變化，整體上miR-15a/miR-16與Bcl-2 mRNA、Bcl-2呈負向表達。
　　4.同時予以NPY增強劑及上調(diào)miR-15a/miR-16后Bcl-2 mRNA和Bcl-2表達比單獨應用NPY增強劑時低，比單獨上調(diào)miR-1

7、5a/miR-16后高。
　　5.NPY、Bcl-2表達增高時αT3細胞周期趨向分裂期改變；NPY、Bcl-2表達降低時αT3細胞趨向細胞周期阻滯。Ⅷ、Ⅸ組G1期細胞比例較Ⅰ組合Ⅱ組大，較Ⅲ組小。
　　6.Ⅱ組的NPY表達和αT3細胞增殖活性存在顯著線性正相關(guān)關(guān)系；Bcl-2也與αT3細胞增殖活性呈正向關(guān)系。Ⅷ、Ⅸ組αT3細胞增殖活性較Ⅰ組和Ⅱ組低，比Ⅲ組高。
　　結(jié)論：
　　1.各組中NPY與Bcl-2呈同向表

8、達趨勢，NPY與miR-15a/miR-16呈負向表達，在NPY增強干預組內(nèi)，miR-15a/miR-16與Bcl-2呈線性負相關(guān)關(guān)系。推測NPY可能通過作用于miR-15a/miR-16正向調(diào)節(jié)Bcl-2的表達。
　　2.整體上miR-15a/miR-16與Bcl-2 mRNA、Bcl-2呈負向表達， miR-15a/miR-16對NPY mRNA和NPY的負向作用輕微。
　　3.Ⅷ、Ⅸ組結(jié)果表明Bcl-2可能同時受到NP

9、Y與miR-15a/miR-16的影響，更支持NPY可能通過影響miR-15a/miR-16進而改變Bcl-2的表達。
　　4.NPY和Bcl-2可能與αT3細胞周期和細胞增殖活性有關(guān)。拮抗NPY表達后細胞增殖活性降低，提示拮抗NPY有可能成為治療垂體腺瘤的方式之一。
　　5.實驗表明Bcl-2可在早期受到來自被NPY抑制表達的 miR-15a/miR-16的作用；持續(xù)表達增強的Bcl-2與αT3細胞的G1期細胞比例表現(xiàn)為負