不同缺氧時間下αB-晶體蛋白對心肌細胞凋亡途徑中半胱天冬蛋白酶-3活化的抑制作用.pdf

1、目的： 離體條件下將αB-晶體蛋白基因轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的大鼠心肌細胞，觀察轉(zhuǎn)染后心肌細胞內(nèi)αB-晶體蛋白的表達；在缺氧/復氧條件下，觀察隨著缺氧時間延長αB-晶體蛋白對原代培養(yǎng)心肌細胞中caspase-3的影響。 方法： 1．取出生3天以內(nèi)的SD(Sprague-Dawley)大鼠乳鼠心臟，利用酶消化法和差速貼壁法分離心肌細胞。通過倒置相差顯微鏡觀察培養(yǎng)細胞的生長狀態(tài)，采用HE染色法、α-actin免疫細胞化學法鑒定

2、培養(yǎng)細胞類型及心肌細胞特征。 2．提取pEGFP-C3和pEGFP-αB-crystallin-C3質(zhì)粒，并經(jīng)酶切和測序鑒定：以陽離子脂質(zhì)體(Lipofectamine<'TM> 2000)介導pEGFP-C3和pEGFP-αB-crystallin-C3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染心肌細胞并計算轉(zhuǎn)染效率。將培養(yǎng)的心肌細胞分為轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染pEGFP-αB-crystallin-C3)、空載組(轉(zhuǎn)染pEGFP-C3)和空白組(無任何質(zhì)粒轉(zhuǎn)染)，轉(zhuǎn)染后

3、分別缺氧培養(yǎng)6、12、18小時后復氧12小時，用蛋白印跡法(Westem Blot)半定量檢測αB-晶體蛋白和caspase-13活化產(chǎn)物p17表達。 結果： 1．成功培養(yǎng)出大鼠心肌細胞并經(jīng)HE染色和免疫組化證實。 2．成功將αB-晶體蛋白基因轉(zhuǎn)染大鼠的心肌細胞，熒光顯微鏡下可見綠色熒光蛋白的表達，Western Blot檢測提示蛋白表達量較對照組明顯增加(P<0.05)。 3．轉(zhuǎn)染后缺氧培養(yǎng)6、12、1

4、8小時復氧12小時后，轉(zhuǎn)染組心肌細胞αB-晶體蛋白表達有下降趨勢，但沒有統(tǒng)計學意義義(P>0.05)；轉(zhuǎn)染組caspase-3活化產(chǎn)物p17與空白組和空載組比較，明顯降低(P<0.05)，在缺氧6-18小時內(nèi)，隨缺氧時間延長，表達相對穩(wěn)定，有下降趨勢但沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)；在缺氧12小時后，各組p17表達量趨于平穩(wěn)。 結論： 1．體外條件下成功分離、培養(yǎng)出乳鼠心肌細胞。 2．將αB-晶體蛋白基因成功轉(zhuǎn)染