紅細胞冰凍干燥保存研究.pdf

1、目前，紅細胞保存為4℃下的短期保存和-80℃或-196℃深低溫長期保存，前者保存期為35天-42天，由于保存期短，往往造成大量紅細胞的浪費。后者保存期可長達10年，但應(yīng)用臨床需要洗滌，耗時費力，保存費用昂貴，僅用于稀有血型的保存?，F(xiàn)今的紅細胞保存方法，遠遠不能滿足臨床急救和突發(fā)事件或災(zāi)害事故的救援。由于凍干紅細胞為固體干粉劑，能在常溫下保存，性能穩(wěn)定，保存時間長，輸注方便，保存費用低廉，便于運輸減少了震蕩溶血等優(yōu)點，紅細胞冰凍干燥保存已

2、成為近期研究的熱點。 從上世紀60年代末，科學(xué)家開始了對凍干紅細胞的研究，歷經(jīng)30多年，收效甚微。低溫和干燥對紅細胞膜損傷，細胞內(nèi)血紅蛋白外漏是影響紅細胞凍干成功的最大障礙?？茖W(xué)家[1]從一些耐低溫和干旱的微生物、低溫休眠動物和耐干旱植物中得到了靈感。這些抗干旱生物體，在脫水達90％仍能生存，遇水后恢復(fù)正常的生理功能。研究發(fā)現(xiàn)，此類微生物在脫水時，體內(nèi)可分泌大量的二糖，尤其是海藻糖，海藻糖可占其干燥體重的20％。海藻糖是葡萄糖的

3、二聚體，是一種非還原性二糖，化學(xué)性質(zhì)十分穩(wěn)定，無任何毒副作用，在低溫、干燥狀態(tài)下對生物材料有保護作用，能穩(wěn)定生物膜，是低溫生物領(lǐng)域最佳的保護劑，被廣泛應(yīng)用于細胞、器官和各種組織的保存中。 科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，海藻糖只有分布于細胞膜內(nèi)外兩側(cè)，且達到一定的濃度，才能在低溫和干燥狀態(tài)下發(fā)揮生物學(xué)保護作用。而海藻糖一般不能透過細胞膜，如何將海藻糖導(dǎo)入細胞內(nèi)，對低溫工作者是一個巨大的挑戰(zhàn)。BeattieGM(1997)發(fā)現(xiàn)胰島分泌細胞在冰點以上

4、時具有膜脂相變現(xiàn)象，利用膜相變時，膜分子之間的空隙增大，將海藻糖成功的導(dǎo)入胰島細胞。Guo和Puhlev等人(2000)通過轉(zhuǎn)基因的方法使人的成纖維細胞表達了編碼6-磷酸-海藻糖合成酶和6-磷酸-海藻糖磷酸酶，結(jié)果發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性海藻糖可以提高哺乳動物細胞的干燥耐受性。AliEroglu(2000)等人采用金黃色葡萄球菌a-溶血素的基因突變體在人成纖維細胞膜和角質(zhì)細胞膜上打孔的方法使海藻糖進入細胞內(nèi)，然后進行深低溫保存。CroweJH(200

5、1)等人發(fā)現(xiàn)血小板通過細胞內(nèi)吞作用可以將海藻糖分子吸收到細胞內(nèi)，吸收效率達到50％以上。Roser(2001)通過電子打孔的方法，使海藻糖充分進入細胞，然后在37℃下于干燥機上進行干燥處理。Eroglu等人(2002)通過顯微注射的方法將海藻糖注射入人卵母細胞內(nèi)，然后再進行低溫保存。Oliver等人(2004)利用間充質(zhì)干細胞的液相內(nèi)吞作用將海藻糖導(dǎo)入細胞內(nèi)。Satpathy等人(2004)綜合前人的研究和紅細胞本身的特點，利用滲透非平

6、衡和磷脂相變相結(jié)合的辦法將海藻糖導(dǎo)入紅細胞內(nèi)。海藻糖成功的導(dǎo)入紅細胞內(nèi)，將為紅細胞的冷凍干燥保存，奠定了基礎(chǔ)。 Satpathy等人(2004)將海藻糖負載的紅細胞進行凍干保存，血紅蛋白回收率達59％，且凍干紅細胞的各項生理功能正常。為紅細胞的臨床輸注，邁出了重要的一步。 目的： 1、研究海藻糖負載紅細胞的方法：篩選海藻糖負載液的最佳濃度；研究溫度和時間對海藻糖負載紅細胞的影響，篩選最佳溫度和時間組合條件；研究苯

7、甲醇對海藻糖負載紅細胞的影響，篩選最佳的苯甲醇負載液濃度。通過負載紅細胞內(nèi)海藻糖濃度、負載過程中紅細胞溶血率、負載后紅細胞的形態(tài)、變形性、滲透脆性、ATP水平等評價海藻糖負載紅細胞方法的可行性。 2、測定負載海藻糖的紅細胞凍干后血紅蛋白回收率，以明確海藻糖的保護作用。篩選最佳的紅細胞凍干保護體系。研究凍干紅細胞含水量和血紅蛋白回收率之間的關(guān)系。 3、研究再水化液溫度和不同種類再水化液對凍干紅細胞血紅蛋白回收率的影響，篩選

8、最佳的再水化液溫度和最有效的再水化體系。 4、比較海藻糖、蔗糖、葡萄糖負載紅細胞的凍干保護效果，明確其凍干保護作用，為海藻糖負載紅細胞技術(shù)的優(yōu)化和改進做基礎(chǔ)。 方法： 1、用不同濃度的海藻糖外液負載紅細胞，用硫酸-蒽酮法測定各濃度組負載紅細胞的海藻糖負載率，用氰化血紅蛋白法測定負載紅細胞溶血率，選出最佳海藻糖負載液濃度。 2、在不同溫度和時間下用海藻糖負載紅細胞，用硫酸-蒽酮法測定紅細胞海藻糖負載率，氰化

9、血紅蛋白法測定負載紅細胞溶血率，明確海藻糖負載紅細胞的影響因素，選出最佳的負載條件。 3、從負載紅細胞的形態(tài)、負載紅細胞內(nèi)海藻糖濃度、細胞的溶血率、變形性、滲透脆性、紅細胞內(nèi)的ATP水平等方面，評價海藻糖負載后細胞的功能，進一步評價此負載方法的可行性。 4、添加各種凍干保護劑，凍干負載海藻糖的紅細胞，比較各種保護劑的凍干保護效果，篩選出最佳保護體系。 5、在不同溫度下再水化凍干紅細胞，用不同的血漿增量劑再水化凍干

10、紅細胞，測定凍干紅細胞血紅蛋白回收率，選出最佳的再水化溫度和最有效的再水化體系，明確再水化機理。 6、比較經(jīng)海藻糖、蔗糖、葡萄糖負載的凍干紅細胞血紅蛋白的回收率及凍干紅細胞內(nèi)ATP水平，以明確海藻糖、蔗糖、葡萄糖對凍干紅細胞的保護作用。結(jié)果： 1、用0.2M、0.4M、0.6M、0.8M、1.0M不同濃度的海藻糖負載液負載紅細胞，測定紅細胞海藻糖負載率及溶血率數(shù)據(jù)，用隨機區(qū)組方差分析方法統(tǒng)計處理，各組間均有差異，P＜0.

11、05。0.8M是最佳的海藻糖負載濃度。 2、將紅細胞負載樣品分別在4℃，15℃，23℃，37℃，41℃條件孵育3h、6h、9h、16h，測定紅細胞海藻糖負載率及溶血率數(shù)據(jù)，用重復(fù)測量兩因素方差分析方法統(tǒng)計處理，不同溫度之間、不同時間之間，差異均有顯著性意義P=0.000。其中37℃，6-7小時是最佳的負載條件。 3、用濃度分別為10mM、30mM、50mM、100mM的苯甲醇海藻糖負載液負載紅細胞，測定紅細胞海藻糖負載率

12、及溶血率數(shù)據(jù)，用隨機區(qū)組方差分析方法統(tǒng)計處理各組間均有差異，P＜0.05。50mM是最佳的苯甲醇負載濃度。 4、用0.8M海藻糖負載濃度，在37℃下孵育7小時后紅細胞內(nèi)海藻糖含量為36.56±7.95mM。 5、經(jīng)海藻糖負載的紅細胞變形性降低，與對照組相比，P=0.000差異有顯著性意義。 6、經(jīng)海藻糖負載的紅細胞，細胞內(nèi)ATP水平降低，與對照組相比，差異無顯著性意義。 7、經(jīng)海藻糖負載的紅細胞，細胞滲透

13、脆性降低，與對照組相比，P=0.000差異有顯著性意義。 8、海藻糖負載的紅細胞凍干，海藻糖負載組和對照組血紅蛋白回收率有差異，t=24.036，P=0.000，差異有顯著性意義。白蛋白、高濃度的PVP對凍干紅細胞有保護作用，葡聚糖對凍干紅細胞幾乎無保護作用，甘油對凍干紅細胞起破壞作用。多組保護體系相比較，羥乙基淀粉+白蛋白組保護效果最好，40％PVP+HAS+DMSO組其次。 9、選用溫度分別為4℃、15℃、25℃、3

14、7℃、41℃的再水化液再水化凍干紅細胞，溫度為4℃、15℃、25℃時，凍干紅細胞不能完全再水化。37℃、41℃的再水化液再水化凍干紅細胞，數(shù)據(jù)顯示P=0.004，差異有顯著性意義。37℃的再水化效果強于41℃。用臨床常用的血漿增量劑右旋糖苷、羥乙基淀粉和生理鹽水做凍干紅細胞再水化液，再水化后血紅蛋白回收率，生理鹽水組與其它各組相比較，P=0.001，差異有顯著性意義。而右旋糖苷組與羥乙基淀粉組差異無顯著性意義。同時在各種水化液中加入蔗糖

15、，蔗糖對凍干紅細胞血紅蛋白回收率影響不一致。 10、凍干紅細胞的含水量影響著凍干紅細胞血紅蛋白回收率，含水量8-10％組與3-4％組血紅蛋白回收率相比較，P=0.000，差異有顯著性意義。 11、經(jīng)海藻糖、蔗糖、葡萄糖負載紅細胞，凍干后血紅蛋白回收率數(shù)據(jù)用隨機區(qū)組方差分析統(tǒng)計方法處理，海藻糖組、蔗糖組、葡萄糖組與PBS組相比較，P=0.000差異有顯著性意義。葡萄糖組與海藻糖組、蔗糖組相比較，P=0.000，差異有顯著性

16、意義；蔗糖組和海藻糖組相比較，P=0.789，差異無顯著性意義。說明，蔗糖和海藻糖保護效果幾乎相等。但從ATP水平數(shù)據(jù)顯示，葡萄糖組與海藻糖組、蔗糖組相比較，P=0.000，差異有顯著性意義；但蔗糖組和海藻糖組相比較，P=0.015，差異有顯著性意義。蔗糖負載的紅細胞，凍干后細胞內(nèi)ATP水平低于國際輸注標(biāo)準，而海藻糖負載的紅細胞，凍干后紅細胞內(nèi)ATP水平高于國際臨床輸注標(biāo)準。 結(jié)論： 1、海藻糖負載紅細胞最適宜的濃度是0

17、.8M；37℃，6-7小時是海藻糖負載紅細胞的最佳條件。苯甲醇能增強細胞膜流動性，增加海藻糖負載率。50mM苯甲醇濃度是較適宜的負載濃度。 2、經(jīng)海藻糖負載的紅細胞，凍干后血紅蛋白回收率明顯提高，且生理功能正常，符合輸注標(biāo)準。海藻糖、人血白蛋白、聚乙烯吡個咯烷酮對凍干紅細胞均有保護作用。低濃度的葡聚糖對凍干紅細胞幾乎無保護作用，甘油對凍干紅細胞起破壞作用。 3、37℃是凍干紅細胞再水化的適宜溫度，臨床上應(yīng)用的右旋糖苷及羥