普通肝素在感染性休克中對肝素結(jié)合蛋白介導(dǎo)的微循環(huán)及線粒體氧代謝功能障礙的保護(hù)性作用及機(jī)制研究.pdf

1、膿毒癥以及感染性休克是一種與微循環(huán)和線粒體功能損傷密切相關(guān)的綜合征。感染性休克時經(jīng)積極抗感染、容量復(fù)蘇治療，大循環(huán)基本穩(wěn)定后，病人的器官功能仍可能惡化，這可能是微循環(huán)及氧代謝障礙仍然存在的緣故。微循環(huán)障礙和線粒體損傷互為因果，共同導(dǎo)致膿毒癥進(jìn)一步發(fā)展為MODS。肝素結(jié)合蛋白(HBP)具有多種生物活性，可以趨化并激活單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，促進(jìn)炎癥介質(zhì)釋放明顯增加;通過小G蛋白家族的Rho激酶途徑影響細(xì)胞骨架從而使內(nèi)皮細(xì)胞的通透性增加;被內(nèi)皮

2、細(xì)胞攝取并聚集在線粒體區(qū)域，影響線粒體在細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)方面的作用。但是至今尚無文獻(xiàn)證實肝素結(jié)合蛋白具有抑制線粒體氧代謝功能的作用。另外，肝素結(jié)合蛋白的濃度與感染性休克的嚴(yán)重程度相關(guān)。針對肝素結(jié)合蛋白的干預(yù)措施，可能作為治療早期膿毒癥的手段。
　　肝素不僅僅局限于傳統(tǒng)意義的抗凝作用，而對膿毒癥具有治療作用。一方面肝素可以降低膿毒癥大鼠IL-6，TNF-α等炎癥介質(zhì)的表達(dá)，改善膿毒癥大鼠的凝血及炎癥反應(yīng)。并可以通過抑制炎癥反應(yīng)保護(hù)膿毒癥

3、引起的急性肺損傷。另一方面肝素可以影響內(nèi)皮細(xì)胞在炎癥表達(dá)及微循環(huán)調(diào)節(jié)方面的作用，改善膿毒癥時內(nèi)皮細(xì)胞RhoA/Rho激酶途徑所致的通透性改變。相對以上肝素對炎癥及內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用，肝素結(jié)合蛋白對內(nèi)皮細(xì)胞及炎癥反應(yīng)的作用恰恰與之相反。另外，肝素結(jié)合蛋白與肝素具有高親和力的現(xiàn)象已被發(fā)現(xiàn)，不難推測肝素在膿毒癥/感染性休克時表現(xiàn)出的保護(hù)性作用可能與拮抗肝素結(jié)合蛋白有關(guān)。但是目前尚無研究探討血漿肝素結(jié)合蛋白濃度與微循環(huán)，線粒體氧代謝功能的關(guān)系。

4、
　　綜上，本課題試圖從微循環(huán)及氧代謝的角度，以肝素結(jié)合蛋白作為橋梁，探求肝素治療感染性休克的內(nèi)在機(jī)制，并證實肝素結(jié)合蛋白在線粒體氧代謝功能方面的作用。
　　方法1:在體實驗，早期感染性休克犬血漿肝素結(jié)合蛋白濃度與微循環(huán)，線粒體氧代謝功能的關(guān)系及肝素的保護(hù)性作用。將實驗用比格犬隨機(jī)分成四組:假手術(shù)組，僅進(jìn)行手術(shù)操作，不注射LPS及液體復(fù)蘇。LPS組，進(jìn)行手術(shù)操作并注射LPS，但不給予任何液體治療?；局委熃M，進(jìn)行手術(shù)操作并注

5、射LPS，給與NS進(jìn)行液體復(fù)蘇。肝素治療組，進(jìn)行手術(shù)操作并注射LPS，給與生理鹽水+肝素治療。術(shù)后穩(wěn)定1小時，即T0點(diǎn)，給LPS造模后1小時，即T1點(diǎn)，之后序貫觀察5小時分別為T2，T3，T4，T5，T6點(diǎn)。在每一時間點(diǎn)測定MAP，經(jīng)造瘺口插入OPS探頭觀察并記錄腸絨毛微循環(huán)狀態(tài)。分別于T0，T1，T3，T6點(diǎn)留取血液（嚴(yán)格控制共計采血量小于全血量的10％）經(jīng)1500轉(zhuǎn)，15分鐘離心后取血漿，以EP管分裝后置入-80℃保存，用作檢測血漿

6、肝素結(jié)合蛋白濃度。T6點(diǎn)以10％ KCl20ml快速靜推處死動物，迅速取小腸，置入-80℃保存，用作制備組織勻漿檢測CoxⅡ、CoxⅣ。以上實驗流程及干預(yù)均設(shè)立嚴(yán)格的執(zhí)行及質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。
　　方法2:體外實驗:肝素結(jié)合蛋白介導(dǎo)HUVECs的線粒體氧代謝功能障礙及肝素的保護(hù)性作用。將HUVECs分別給予HBP，肝素+HBP，肝素處理。分別從線粒體的形態(tài)學(xué)，膜電位及氧化呼吸鏈的關(guān)鍵酶的蛋白及基因表達(dá)層面評價其功能。HUVECs根據(jù)上述干預(yù)

7、條件作用后采用了顯微鏡觀察線粒體形態(tài)學(xué)變化，JC-1法測定線粒體膜電位，Western blotting及FQ-PCR檢測線粒體氧化呼吸鏈關(guān)鍵酶CoxⅡ，CoxⅣ表達(dá)。
　　方法3:體外實驗:肝素拮抗肝素結(jié)合蛋白介導(dǎo)HUVECs的線粒體氧代謝功能障礙的機(jī)制。將HUVECs分別給予HBP，肝素+HBP，肝素處理。因HBP不在HUVECs內(nèi)表達(dá)，外源性加入HBP后，檢測其在胞漿內(nèi)的相對表達(dá)量即表示其進(jìn)入HUVECs的程度。經(jīng)上述干預(yù)條

8、件處理后，采用免疫熒光及Western blotting分析HUVECs胞漿內(nèi)HBP表達(dá)的變化。
　　結(jié)果1:1）普通肝素干預(yù)可以明顯改善膿毒癥時的微循環(huán)障礙。2）血漿HBP濃度水平與PVD，PPV，MFI成反比。3）普通肝素干預(yù)可以降低血漿HBP濃度。4)血漿HBP濃度水平與線粒體內(nèi)CoxⅡ表達(dá)成反比。5）普通肝素干預(yù)可以改善膿毒癥時CoxⅡ的表達(dá)。
　　結(jié)果2:1）HBP可以明顯降低線粒體膜電位，肝素預(yù)處理使HBP抑制線

9、粒體膜電位作用減弱。2）HBP可以造成線粒體形態(tài)完整性的破壞，肝素預(yù)處理后使HBP造成的線粒體形態(tài)完整性破壞作用減弱。3）HBP可以下調(diào)CoxⅡ蛋白及基因表達(dá)，肝素預(yù)處理后使HBP引起的CoxⅡ蛋白及基因表達(dá)下調(diào)作用減弱。
　　結(jié)果3:免疫熒光與western blotting定性及定量測定HBP可以進(jìn)入HUVECs胞漿內(nèi)，肝素預(yù)處理后HBP進(jìn)入HUVECs胞漿減少。
　　結(jié)論:
　　1.肝素對膿毒癥時微循環(huán)障礙具有保