卡培他濱與放射線照射聯(lián)合治療子宮頸腺癌的效果與機(jī)制探討.pdf

1、卡培他濱(capecitabine，CAP)是一種口服型5—氟尿嘧啶(5—fluorouracil，5—FU)前體類抗腫瘤新藥。CAP的藥物設(shè)計(jì)，使其本身無(wú)毒無(wú)活性，在胃腸道可以原藥形式快速吸收，在肝臟和腫瘤組織中三種酶的作用下轉(zhuǎn)化形成5—FU而發(fā)揮抗腫瘤活性。最終5—FU由二氫嘧啶脫氫酶(dihydropyrinudine dehydrogenase，DPD)代謝失活。在其轉(zhuǎn)化過程中，胸腺嘧啶核苷磷酸化酶(thymidine phos

2、phorylase，TP)是其活化最后一環(huán)的一個(gè)限制酶，TP的特點(diǎn)在多數(shù)實(shí)體腫瘤組織中濃度較高，明顯高于正常組織。這使得CAP在正常組織中生成5—FU量較少，而在腫瘤組織局部可有高濃度5—FU生成，大大增強(qiáng)了抗腫瘤活性，降低了5—FU對(duì)正常組織的毒副作用。因此，CAP全身毒性反應(yīng)輕且選擇性抗腫瘤，是目前口服制劑中唯一能超過靜脈給藥的氟尿嘧啶類藥物，彌補(bǔ)了5FU毒性大用量受限的缺撼。臨床上已被用于紫杉醇、阿霉素等耐藥的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移性乳腺癌及晚

3、期結(jié)腸癌等患者的治療，取得了很好的效果。關(guān)于CAP療效方面的研究，由于TP是CAP選擇性作用于腫瘤的關(guān)鍵酶，而成為研究的焦點(diǎn)。人們致力于增加TP的表達(dá)來提高CAP的療效。研究顯示，放射可使多種腫瘤組織TP表達(dá)明顯增高，CAP和放射聯(lián)合應(yīng)用無(wú)論用于輔助治療、術(shù)前放化療、還是姑息治療，均能得到較好的效果，是一種有前途的腫瘤治療方法。另外研究還發(fā)現(xiàn)，DPD在CAP治療中也發(fā)揮著重要作用，TP/DPD的比值更直接的關(guān)系到CAP的療效。提示在化療

4、之前測(cè)定腫瘤相關(guān)酶的水平，能選擇到更適合接受CAP治療的人群。 子宮頸癌有著較高的發(fā)病率，其治療主要還是以手術(shù)和放療為主，可使部分患者得到根治或緩解，但有部分患者單純放療仍然預(yù)后不佳。尤其是宮頸腺癌，不如宮頸鱗癌對(duì)放射線敏感，臨床期別較晚、淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移的患者，初始治療后很快又復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移。且其發(fā)病還有逐漸增加趨勢(shì)。因此為改善預(yù)后，臨床迫切需要探討對(duì)宮頸腺癌更為有效的療法。近年來新輔助化療即術(shù)前或放療前進(jìn)行化療，確實(shí)一定程度上提高了

5、手術(shù)或/和放療的效果。故而尋找對(duì)宮頸腺癌更有效的新輔助化療方案的有關(guān)研究出現(xiàn)許多。CAP也已被用于多種人宮頸癌細(xì)胞株動(dòng)物移植模型中進(jìn)行研究，顯示出了一定的抑癌效果，在人宮頸腺癌HeLa細(xì)胞株動(dòng)物移植模型中CAP的抑瘤率可達(dá)34.6％。但CAP與放射聯(lián)合在宮頸腺癌中的作用如何尚未見報(bào)道。介于CAP高效低毒的藥物特點(diǎn)和5—FU所具有的放射增敏作用，將CAP與放射聯(lián)合用于宮頸腺癌，效果值得期待。因此本研究采用人子宮頸腺癌細(xì)胞株異種移植于裸鼠建

6、立動(dòng)物模型，觀察了CAP和放射線聯(lián)合治療在宮頸腺癌中的抗腫瘤效果。并通過放射線照射對(duì)宮頸腺癌細(xì)胞TP、DPD酶影響的研究，及觀察聯(lián)合治療后宮頸腺癌細(xì)胞周期的變化，對(duì)其聯(lián)合治療效果的機(jī)制進(jìn)行了探討。 實(shí)驗(yàn)材料和方法： 一、實(shí)驗(yàn)材料 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雌性BALB/c nu/nu裸鼠(5或6周齡，體重約20克)約220只。 2、細(xì)胞株：人宮頸腺癌CAC—1細(xì)胞株從日本札幌醫(yī)科大學(xué)獲得，人宮頸腺癌HeLa細(xì)胞株由中

7、國(guó)醫(yī)科大學(xué)盛京醫(yī)院感染科實(shí)驗(yàn)室提供。 3、主要試劑及藥品：CAP由F—Hofmann—Roche(Besle Switzerland)提供。5—FU購(gòu)買于Kyowa Hakko Co(Tokyo Japan)和上海旭東海普藥業(yè)公司。培養(yǎng)基(海克隆生物化學(xué)制品北京有限公司)；0.1mg/ml考馬斯亮藍(lán)溶液(進(jìn)口分裝，上海化學(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)站)；牛血清白蛋白(Sigma公司)；ELISA法測(cè)定TP酶的試劑盒(德國(guó)羅氏公司)；總RNA提

8、取液Trizol(東勝創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司)；cDNA第一鏈合成逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒、Taq DNA、聚合酶DNA Marker(大連寶生物工程有限公司)；TP、DPD引物(上海Invitrogen英俊生物技術(shù)有限公司合成)；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)(Sigma公司)，DMSO試劑二甲基亞砜(北京夏斯生物技術(shù)有限公司)，碘化丙啶(PI)(sigma公司)。 4、主要實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備： 超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠)；瓦

9、里安直線加速器2300C/D—SN293(美國(guó))；超聲粉碎機(jī)UP200H(德國(guó))；DV600分光光度計(jì)(美國(guó))：振蕩機(jī)RS—232(美國(guó))；酶標(biāo)儀GIS—1000 Tanon(上海天能科技有限公司)；紫外分光光度儀Wellscan MK3(德國(guó))；電泳儀BIO—RADpower/PAC300(美國(guó))；PCR儀PTC—100(美國(guó))；凝膠成像分析系統(tǒng)(基因有限公司)；流式細(xì)胞儀(FACS—440型)；Mitsubishi電子射線裝置(機(jī)型

10、EXL-15DP，4MeV，劑量率5Gy/分)。 二、實(shí)驗(yàn)方法 1、人宮頸腺癌CAC—1細(xì)胞株動(dòng)物移植模型建立及治療效果評(píng)價(jià) 在每只裸鼠左下肢外上方皮下，接種含2×106個(gè)細(xì)胞的CAC—1單細(xì)胞懸液0.2ml。在局部有腫瘤塊生長(zhǎng)并達(dá)一定程度時(shí)開始進(jìn)行腫瘤治療。治療前將攜瘤鼠分成對(duì)照組、CAP組、5—FU組、放射組、CAP+放射組和5—FU+放射組。并設(shè)腫瘤大小不同的兩大組，在大、小瘤組又分別分出對(duì)照組、CAP組、

11、放射組、CAP+放射組。CAP、5—FU每天被分別投給它們最大耐受劑量(MTD)的1/2或2/3。每周投藥6天，連續(xù)投藥兩周。對(duì)需行放射的攜瘤鼠分別于投藥第4天進(jìn)行一次性4、5、6Gy局部照射，以及投藥周的第1、2、4、5天進(jìn)行日一次2Gy的局部照射，兩周共照射8天。藥物、照射等的療效評(píng)價(jià)通過觀察腫瘤體積的變化來進(jìn)行。計(jì)算腫瘤增殖百分率，將腫瘤增殖百分率與所經(jīng)過的時(shí)間繪制成腫瘤增殖曲線圖，以此評(píng)價(jià)腫瘤被抑制程度。T2.5表示腫瘤體積從治

12、療第1天的體積到生長(zhǎng)達(dá)其2.5倍時(shí)所需的時(shí)間，以此推算腫瘤生長(zhǎng)延遲天數(shù)。 2、人宮頸腺癌HeLa細(xì)胞TP，DPD酶表達(dá)的測(cè)定 將宮頸腺癌HeLa細(xì)胞按X線照射的不同劑量分成對(duì)照組(0Gy)及2Gy、6Gy放射組。分別于照射前1天(第0天)，照射后第1天，第3天，第5天，第7天，第9天收集細(xì)胞，制成測(cè)定樣本凍存。ELISA測(cè)定HeLa細(xì)胞照射前后TP酶蛋白含量。RT-PCR檢測(cè)HeLa細(xì)胞放射前后TP，DPD酶mRNA表達(dá)

13、。 3、人宮頸腺癌HeLa細(xì)胞周期的測(cè)定 先以MTT法行5—FU處理48h半數(shù)抑制濃度(IC50)測(cè)定，為125μg/ml。再將HeLa細(xì)胞分成對(duì)照組(不加藥，不照射)、5—FU組、放射組、5—FU+放射組(藥物和放射同時(shí)投給)。各組根據(jù)不同時(shí)間經(jīng)過又分成12、24、48h三組。藥物組是以48h IC50濃度的5—FU處理相應(yīng)各組細(xì)胞，12、24、48h后將細(xì)胞收集。需照射的各組細(xì)胞在室溫下進(jìn)行單次6Gy的X射線照射，照

14、射后繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48h再收集細(xì)胞。行冰乙醇固定備測(cè)。細(xì)胞周期測(cè)定前先行PI染色，后以流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞周期變化，測(cè)定G0/G1、S、G2/M期細(xì)胞。 結(jié)論： 1、對(duì)于宮頸腺癌CAC—1應(yīng)用CAP與放射聯(lián)合治療能產(chǎn)生相互協(xié)同增效作用，有明顯的腫瘤抑制效果，是一種有效的治療子宮頸腺癌的方法。其效果優(yōu)于單純CAP及單純放射的治療，也優(yōu)于5—FU直接和放射聯(lián)合的效果。CAP對(duì)放射的增強(qiáng)作用比5—FU強(qiáng)。 2、

15、CAP與放射聯(lián)合治療的效果與CAP藥物濃度、放射劑量、照射方法及腫瘤大小有關(guān)。2/3MTD CAP分別和5、6Gy及2Gy×8放射聯(lián)合治療時(shí)，腫瘤抑制的效果較好。CAP與小劑量多次放射方法的聯(lián)合治療，較CAP與單次放射方法聯(lián)合，更顯示出了明顯的抑瘤效果。體積較大的腫瘤，對(duì)CAP與放射聯(lián)合治療的反應(yīng)敏感，比體積較小的腫瘤治療效果好，可能CAP與放射聯(lián)合治療對(duì)較晚期子宮頸腺癌更為有效。 3、放射線照射，能提高子宮頸腺癌HeLa細(xì)胞T

16、P酶的mRNA表達(dá)和TP酶蛋白水平，而DPD酶mRNA表達(dá)不受影響，因此放射后HeLa細(xì)胞TP/DPD比值升高，能增加其對(duì)CAP的敏感性。 4、5—FU與放射聯(lián)合，兩者對(duì)HeLa細(xì)胞周期均有影響，其細(xì)胞G2/M、S及G0/G1各期都有變化，但主要還是以S期細(xì)胞阻滯即5—FU的影響為主。其聯(lián)合作用引起的細(xì)胞周期變化，在處理后的24小時(shí)最為顯著。HeLa細(xì)胞表現(xiàn)出對(duì)5—FU的作用比對(duì)放射更敏感，可以認(rèn)為在兩者的聯(lián)合作用中，5—FU通