HCV的抗體依賴性感染增強(qiáng)的體外實驗研究.pdf

1、為探討HCV母嬰傳播過程中的可能存在的ADE機(jī)制,我們進(jìn)行了如下工作:一、改良法分離滋養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞的分離培養(yǎng):滋養(yǎng)層細(xì)胞的分離培養(yǎng)實驗參照國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)并加以改進(jìn),采用胰蛋白酶消化法消化人足月胎盤絨毛組織,制成單細(xì)胞懸液,以35％及45%兩層Percoll密度梯度分離純化單細(xì)胞懸液,以得到滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng).經(jīng)免疫組化染色及透射電鏡觀察證實,改良后的分離純化方法得3到了較高純度的滋養(yǎng)層細(xì)胞,胞漿中表達(dá)角蛋白、C

2、D16,而無波形蛋白表達(dá),為進(jìn)一步探討HCV母嬰傳播的機(jī)制奠定了細(xì)胞學(xué)實驗基礎(chǔ).二、滋養(yǎng)層細(xì)胞體外感染HCV的免疫電鏡觀察將HCV RNA陽性血清與培養(yǎng)的滋養(yǎng)層細(xì)胞共同孵育,以HCV包膜蛋白為抗原,SPA-膠體金作為標(biāo)記物,進(jìn)行免疫電鏡檢測,發(fā)現(xiàn)了滋養(yǎng)層細(xì)胞內(nèi)被標(biāo)記的HCV病毒顆粒,大小形態(tài)與現(xiàn)有文獻(xiàn)報道相符.可見程度不重的細(xì)胞器改變,主要超微結(jié)構(gòu)改變?yōu)檩p度腫脹,胞質(zhì)密度降低,細(xì)胞器減少等;滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增生,呈囊泡狀、管狀及合狀聚集.實驗

3、為HCV經(jīng)ADE進(jìn)入滋養(yǎng)層細(xì)胞提供理論依據(jù),為HCV母嬰傳播途徑提供了直接的形態(tài)學(xué)支持.三、滋養(yǎng)層細(xì)胞Fc γ RⅢ介導(dǎo)HCV感染的跨膜轉(zhuǎn)運研究以不同方式處理的HCV RNA陽性血清對培養(yǎng)的滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行體外感染試驗,以定性RT-PCR法檢測感染后21d內(nèi)細(xì)胞內(nèi)和培養(yǎng)上清中HCV RNA正負(fù)鏈,同時以免疫組化方法檢測各組細(xì)胞內(nèi)HCV NS5表達(dá).HCV RNA正鏈在對照組、血清補(bǔ)體滅活組、CD16 McAb組均未檢測到,全血清組細(xì)胞內(nèi)外

4、可以間斷測得;HCV RNA負(fù)鏈僅在全血清組細(xì)胞內(nèi)間斷測到.感染6d后檢測胞漿內(nèi)HCV表達(dá)的NS5、NS3、C區(qū)抗原,也僅在全血清組中發(fā)現(xiàn).HCV RNA負(fù)鏈及HCV多抗原在全血清組的短期檢出,表明HCV可以在滋養(yǎng)層細(xì)胞中復(fù)制,但持續(xù)時間有限,ADE機(jī)制在其中可能起作用.該實驗結(jié)果首次證實,HCV感染滋養(yǎng)層細(xì)胞的過程中存在ADE機(jī)制.感染時缺乏補(bǔ)體或使用CD16 McAb,明顯影響HCV進(jìn)入滋養(yǎng)層細(xì)胞,提示抗體和補(bǔ)體均參與了HCV的跨膜