高效毛細(xì)管電泳法和液質(zhì)聯(lián)用法分析測定替考拉寧.pdf

1、自從青霉素被發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于臨床后，抗生素為人類解除絀菌性感染發(fā)揮了巨大的作用。但隨著抗生素在臨床上的廣泛使用，各種耐藥菌不斷出現(xiàn)，細(xì)菌的耐藥性問題逐漸成為關(guān)注的熱點(diǎn)及研究的難點(diǎn)。糖肽類抗生素，尤其以萬古霉素和替考拉寧為代表的抗生素，有效地解決了細(xì)菌耐藥問題，成為抗耐藥性感染的最后一道防線。 替考拉寧(teicoplanin)是Parenti等人于1978年在游動放線菌發(fā)酵產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的一種糖肽類抗生素，它是繼萬古霉素之后用于治療多重

2、耐藥菌感染的重要抗生素之一。 替考拉寧的分子結(jié)構(gòu)、抗菌譜、抗菌活性均與萬古霉素相似。它是由一組化學(xué)結(jié)構(gòu)非常相似的化合物組成的抗生素混合物，其主要成分為：TA2-1、TA2-2、TA2-3、TA2-4、TA2-5、TA3-1等。由于替考拉寧分子結(jié)構(gòu)上增加了脂肪酸側(cè)鏈，相對分子質(zhì)量增大，脂溶性增高，在藥物代謝動力學(xué)上顯示了良好特性。越來越多的證據(jù)表明，在治療革蘭氏陽性菌感染方面，替考拉寧比萬古霉素更具有優(yōu)勢。 目的：建立替考

3、拉寧的高效毛絀管電泳分離方法并對其進(jìn)行定量分析；建立替考拉寧的高效液相色譜分析方法并對其進(jìn)行定量分析；應(yīng)用液質(zhì)聯(lián)用法(LC-MS)對替考拉寧進(jìn)行定性和定量分析。 方法：1.高效毛細(xì)管電泳法。(1)通過表面活性劑的濃度、緩沖液濃度及pH、溫度及電壓的優(yōu)化，選擇最佳的高效毛細(xì)管電泳分離條件，對建立的方法進(jìn)行方法學(xué)驗證。(2)系統(tǒng)適用性試驗：在已確定的高效毛細(xì)管電泳條件下，以組分TA2-2考察系統(tǒng)理論板數(shù)，并考察相鄰組分TA2-4與T

4、A2-5的分離度。(3)精密度試驗：取一份對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計算峰面積的RSD值。(4)檢測限的確定：將替考拉寧對照品溶液逐步稀釋，測量最高噪音峰的峰高，使樣品峰高為噪音峰高的3倍，此時對應(yīng)的替考拉寧的量即為最低檢測限。(5)樣品測定：對三批替考拉寧樣品按照已確定的分離條件進(jìn)行測定。2.快速高效液相色譜法。(1)色譜條件的選擇：選擇不同流動相的組成、配比、流速及柱溫，確定最佳的色譜分離條件。(2)系統(tǒng)適用性試驗：在已

5、確定的高效液相色譜條件下，以組分TA2.2考察系統(tǒng)理論板數(shù)，并考察與相鄰組分TA2-3的分離度。(3)專屬性試驗：在合適的條件下，對替考拉寧樣品進(jìn)行熱、堿、酸、氧化、光、濕的破壞。(4)精密度試驗：取一份對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計算峰面積的RSD值。(5)穩(wěn)定性試驗：取替考拉寧供試品溶液適量，室溫下放置，分別于0、2、4、6、8、12小時，取樣注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計算峰面積的RSD值。(6)線性與范圍：配制一系列濃

6、度的替考拉寧對照品溶液，測定峰面積；以濃度為橫坐標(biāo)，以各個峰相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。(7)最低檢測限的確定：將替考拉寧對照品溶液逐步稀釋，使峰高為噪音峰高的3倍，此時對應(yīng)的替考拉寧的量即為最低檢測限。(8)樣品測定：對三批替考拉寧樣品按照已確定的色譜分離條件進(jìn)行測定。3.液質(zhì)聯(lián)用法。(1)替考拉寧的一級質(zhì)譜分析方法：采用高效液相色譜-電噴霧-四極桿質(zhì)譜儀，通過質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化選擇，建立分析測定替考拉寧中主要組分的方法。(2)替

7、考拉寧的二級質(zhì)譜分析方法：采用高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀，通過質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化選擇，采用母離子和子離子方式檢測，建立分析替考拉寧中主要組分的方法。結(jié)果：1.高效毛細(xì)管電泳法。(1)最佳的高效毛細(xì)管電泳分離條件為：未涂層石英毛細(xì)管67cm×50μm(有效長度60cm)；緩沖液為40mmol·L-1硼砂緩沖液(含3.3％SDS，10mmol·L-1磷酸二氫鈉，用硼酸調(diào)節(jié)PH 9.35)；檢測波長為214nm；電壓為30kv；溫度為30℃

8、；在此條件下，替考拉寧的主要組分均獲得了基線分離。(2)系統(tǒng)適用性：理論板數(shù)按組分A2-2計算為170000，組分TA2-4與TA2-5分離度大于1.5。(3)精密度：按上述條件平行測定6次，組分TA3-1、TA2-1、TA2-2、TA2-3、TA2-4、TA2-5各自峰面積的RSD分別為3.0％、1.7％、0.7％、1.3％、0.7％、0.8％，表明方法精密度良好。(4)最低檢測限：以信噪比S/N=3為指標(biāo)，測得本方法的最低檢測限為0

9、.2％。(5)樣品測定結(jié)果：三批替考拉寧樣品在已確定的分離條件下進(jìn)行了測定，測得組分TA2-2的含量分別63.5％，65.1％，60.2％。2.快速高效液相色譜法。(1)色譜條件：色譜柱： HALOTM-C18色譜柱(4.6×50mm,2.7μm Agt公司)；流動相：A相為15mmol/L乙酸銨(PH 6.0)；B相為乙腈；流速為1.0ml/min；在0-0-5min：B相由18％到23％，在0.5-6min：B相由23％到23％，在

10、6-6-5min：B相由23％到18％，線性梯度。柱溫30℃。檢測波長為214nm，進(jìn)樣量為20μl。(2)系統(tǒng)適用性試驗：理論板數(shù)按組分TA2-2計算為23000，組分TA2-2與TA2-3分離度為1.7。(3)專屬性試驗：替考拉寧樣品進(jìn)行熱、堿、酸、氧化、光、濕破壞，破壞的產(chǎn)物可與主要組分峰基線分離，表明該方法專屬性良好。(4)精密度：按上述條件平行測定6次，組分TA3-1、TA2-1、TA2-2、TA2-3、TA2-4、TA2-5

11、各自峰面積的RSD分別為1.1％，0.48％，0.95％，0.77％，0.44％，0.89％表明方法精密度良好。(5)溶液穩(wěn)定性：取替考拉寧供試品溶液適量，室溫下放置，分別于0、2、4、6、8、12小時，取20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，組分TA3-1、TA2-1、TA2-2、TA2-3、TA2-4、TA2-5各自峰面積的RSD分別為0.58％、0.88％、0.79％、0.68％、0.82％、0.98％，表明樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定

12、。(6)線性與范圍：替考拉寧濃度在0.025-0.40mg/ml范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性，組分TA2-2的線性方程為y=8.949x107x-2400，相關(guān)系數(shù)r為0.9998。(7)最低檢測限：以信噪比S/N=3為指標(biāo)，測得本方法的最低檢測量為0.8ng/ml，最低檢測限為0.02％。(8)樣品測定：三批替考拉寧樣品進(jìn)行了測定，測得組分TA2-2的含量分別62.7％、63.1％、59.3％。3.液質(zhì)聯(lián)用法。(1)一級質(zhì)譜分析。LC-

13、MS條件為：單級四極桿質(zhì)譜，電噴霧電離源(ESI)，正離子檢測，電離電壓3.0KV；錐孔電壓30V；電噴霧接口干燥器(N2)流速280L/h，離子源溫度115℃；脫溶劑氣溫度250℃。組分TA3-1、T2-1、TA2-2、TA213、TA2-4和TA2-5的分子離子峰分別為M/Z 1563、M/Z 1877、M/Z 1879、M/Z 1879、M/Z 1893和M/Z 1893。(2)二級質(zhì)譜分析。LC-MS-MS條件為：三重四極桿質(zhì)譜

14、，采用正離子模式，離子源溫度設(shè)為105℃，離子源電離電壓為3300V，霧化氣流速為500L·hr-1。 采集用母離子和子離子檢測方式。組分TA2-1的母離子為M/Z1877，產(chǎn)生的子離子為M/Z 1197和M/Z 314；組分TA2-2和TA2-3的母離子為M/Z 1879，產(chǎn)生的子離子為M/Z 1181和M/Z 316；組分TA2-4和TA2-5的母離子為M/Z 1893，產(chǎn)生的子離子為M/Z 1198和M/Z 330。結(jié)論：