CGRP介導(dǎo)人體內(nèi)硝酸酯類藥物的藥理作用及與相關(guān)藥物代謝酶的關(guān)系.pdf

1、硝酸酯類藥物是臨床上治療缺血性心肌病及充血性心力衰竭的一類主要藥物。傳統(tǒng)認(rèn)為，有機硝酸酯類藥物通過在體內(nèi)代謝產(chǎn)生NO及NO類似物，激活血管平滑肌或內(nèi)皮細(xì)胞中的鳥甘酸環(huán)化酶（sGC），進(jìn)而使第二信使環(huán)磷酸鳥苷濃度增加，引起動、靜脈舒張而發(fā)揮藥理學(xué)效應(yīng)，NO是此類藥物的最終效應(yīng)分子。 降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）是辣椒素敏感的感覺神經(jīng)的主要遞質(zhì)，也是迄今發(fā)現(xiàn)的最強的舒血管物質(zhì)之一。我們課題組的前期動物實驗研究結(jié)果表明，CGRP介導(dǎo)硝

2、酸甘油的心血管效應(yīng)，且其合成和釋放減少與硝酸甘油耐受性的形成有關(guān)。 硝酸酯類在人體主要通過線粒體醛脫氫酶2（ALDH2）、谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶（GST）、細(xì)胞色素P450系統(tǒng)以及黃嘌呤氧化酶（XOR）等生物轉(zhuǎn)化酶代謝釋放NO。本文在健康中國男性志愿者中探討了CGRP在硝酸酯類藥物心血管效應(yīng)中的作用，并利用ALDH2和GSTM1基因的功能性遺傳多態(tài)性或特異性抑制劑，研究了相關(guān)藥物代謝酶對CGRP介導(dǎo)硝酸酯類藥物藥理作用的影響。

3、第一章降鈣素基因相關(guān)肽介導(dǎo)硝酸甘油的心血管效應(yīng)與ALDH2基因型有關(guān)研究 硝酸甘油為抗心肌缺血的經(jīng)典藥物，廣泛應(yīng)用于治療勞累性穩(wěn)定型心絞痛，不穩(wěn)定型心絞痛，急性心肌梗塞以及慢性充血性心力衰竭，主要通過通過舒張血管，降低心肌前后負(fù)荷，減少心肌耗氧，擴張冠狀動脈而發(fā)揮作用。 降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）是人類用分子生物學(xué)方法發(fā)現(xiàn)的第一個多肽，為辣椒素敏感感覺神經(jīng)的主要遞質(zhì)，廣泛分布于中樞及外周血管組織，是迄今發(fā)現(xiàn)的最強的舒血

4、管物質(zhì)。動物實驗證明，CGRP介導(dǎo)硝酸甘油的舒血管效應(yīng)。 線粒體醛脫氫酶ALDH2是硝酸甘油的主要生物轉(zhuǎn)化酶，催化硝酸甘油轉(zhuǎn)化為1，2-二硝酸甘油和亞硝酸鹽，抑制ALDH2活性或去除細(xì)胞的線粒體可顯著降低硝酸甘油的生物轉(zhuǎn)化，削弱硝酸甘油的舒血管作用。硝酸甘油耐受與心血管線粒體ALDH2酶活性降低有關(guān)。編碼ALDH2基因的第12號外顯子上存在功能性單核苷酸序列多態(tài)性（SNP），該SNP使第504位的谷氨酸被賴氨酸取代（ALDH2*

5、2多態(tài)），這一多態(tài)性導(dǎo)致ALDH2酶活性降低。因此，本實驗在ALDH2酶活性正常和低下的健康志愿者探討了CGRP是否通過ALDH2依賴的方式介導(dǎo)硝酸甘油的心血管效應(yīng)。 方法： 1：ALDH2*2對CGRP介導(dǎo)硝酸甘油藥理效應(yīng)的影響限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）法80名健康中國漢族志愿者的ALDH2進(jìn)行基因分型，隨機選取ALDH2野生型個體及攜帶ALDH2*2等位的個體各9人，舌下含服硝酸甘油0.5mg，分別于服

6、藥前及服藥后不同時間點測定坐位血壓和心率，并于服藥后第12min藥理效應(yīng)達(dá)到最大時抽取3ml外周靜脈血檢測血漿CGRP濃度（放射免疫法）。 2：培養(yǎng)的外周血單個核細(xì)胞（PBMC）硝酸甘油對CGRPmRNA表達(dá)的影響抽取健康志愿者10ml外周靜脈血，分離外周血單個核細(xì)胞并培養(yǎng)，實驗分組：①ALDH2野生型個體對照組；②ALDH2野生型個體+硝酸甘油（10-5M）組；③ALDH2功能缺失個體對照組；④ALDH2功能缺失個體+硝酸甘油

7、（10-5M）組。實時定量PCR測定CGRPⅠ和CGRPⅡmRNA的表達(dá)水平。 3：ALDH2抑制劑水合氯醛對培養(yǎng)的外周血單個核細(xì)胞（PBMCs）硝酸甘油促CGRP合成與釋放的影響抽取3名ALDH2野生型個體健康志愿者外周靜脈血各10ml，分離外周血單個核細(xì)胞并培養(yǎng)，實驗分組：①正常對照組；②10-5M硝酸甘油組；③10-5M硝酸甘油組+1mM水合氯醛組；④1mM水合氯醛組。時定量PCR測定CGRPⅠ和CGRPⅡmRNA的表達(dá)水

8、平。 結(jié)果： （1）與ALDH2酶功能缺失個體（ALDH2*1/*2+ALDH2*2/*2）相比，ALDH2野生型個體收縮壓及心率在含服硝酸甘油后多個時間點呈顯著增高。 （2）志愿者舌下含服硝酸甘油12min后，血漿CGRP濃度顯著升高，CGRP濃度上升的百分率在ALDH2野生型個體表現(xiàn)得更為顯著，血漿CGRP濃度上升的百分率與ASBP及AHR呈明顯正相關(guān)。 （3）硝酸甘油（10-5M）孵育分離的志愿者外

9、周血PBMC24h后，ALDH2野生型個體其CGRPⅠ和CGRPⅡmRNA的表達(dá)上調(diào)程度顯著高于ALDH2酶功能缺失個體。 （4）在ALDH2野生型個體PBMC，硝酸甘油孵育24h可顯著上調(diào)CGRPⅠ和CGRPⅡmRNA的表達(dá)水平，這一效應(yīng)可以被ALDH2抑制劑水合氯醛（1mM）部分阻斷。 結(jié)論： 在健康志愿者體內(nèi)，CGRP通過ALDH2依賴的方式介導(dǎo)硝酸甘油的心血管效應(yīng)。 第二章CGRP介導(dǎo)單硝酸異山梨

10、酯的心血管效應(yīng)與GSTM1基因型相關(guān)研究 硝酸酯類藥物包括硝酸甘油、硝酸異山梨酯與單硝酸異山梨酯等，它們共同的藥理作用基礎(chǔ)是在體內(nèi)釋放NO，后者激活鳥苷酸環(huán)化酶，升高細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸鳥苷水平，進(jìn)而激活cGMP依賴的激酶Ⅰ，使鈣離子通道調(diào)節(jié)蛋白磷酸化而降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，引起血管擴張。 降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）是辣椒素敏感的感覺神經(jīng)的主要遞質(zhì)，由37個氨基酸殘基組成，具有強烈的舒血管效應(yīng)。CGRP可分為CGRPⅠ和CGR

11、PⅡ兩種亞型，分別由不同基因編碼。人類CGRP的合成與釋放受多種內(nèi)源性活性物質(zhì)包括NO的調(diào)節(jié)。 硝酸酯類藥物在體內(nèi)代謝釋放NO的過程涉及多種藥物代謝酶，其中包括線粒體醛脫氫酶2（ALDH2）、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）、黃嘌呤氧化酶（XOR）、細(xì)胞色素P450系統(tǒng)等。谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GSTs）是機體一類重要的Ⅱ相代謝酶。人類GSTs由一個超基因家族編碼，也與硝酸酯類在體內(nèi)的代謝有密切關(guān)系，其中GSTM1存在基因多態(tài)性，表

12、現(xiàn)為該基因部分或全部的缺失，導(dǎo)致其編碼的酶蛋白活性喪失。 黃嘌呤氧化酶（XOR）介導(dǎo)的氧化還原反應(yīng)是體內(nèi)活性氧簇（ROS）產(chǎn)生的來源之一，與心血管疾病的發(fā)生有密切關(guān)系。XOR在NADH存在的條件下可以催化有機硝酸酯類、無機硝酸鹽類和亞硝酸鹽類生成NO。 本研究擬在健康中國志愿者中觀察GSTM1等代謝酶的基因多態(tài)性對單硝酸異山梨酯心血管效應(yīng)的影響及其與CGRP的關(guān)系。 方法： 1：GSTM1基因多態(tài)性對CG

13、RP介導(dǎo)單硝酸異山梨酯藥理效應(yīng)的影響PCR-RFLP對80名健康中國漢族志愿者的ALDH2和GSTM1進(jìn)行基因分型，隨機選取GSTM1野生型個體及GSTM1缺失個體各12人，其中也包括ALDH2正常個體與攜帶ALDH2突變個體各12人?？诜蜗跛岙惿嚼骢?0mg，分別于服藥前及服藥后不同時間點測定坐位血壓和心率，并于服藥后不同時間點各抽取3ml外周靜脈血檢測血漿CGRP濃度（放射免疫法）和單硝酸異山梨酯的血藥濃度（氣象色譜-電子捕獲法）

14、。 2：單硝酸異山梨酯對培養(yǎng)的外周血單個核細(xì)胞CGRP表達(dá)的影響抽取健康志愿者15ml外周靜脈血，分離外周血單個核細(xì)胞并培養(yǎng)，單硝酸異山梨酯（50μM）處理PBMC后，檢測CGRPmRNA表達(dá)；外周血單個核細(xì)胞經(jīng)GST抑制劑依它尼酸（1μM）及黃嘌呤氧化酶抑制劑別嘌呤醇ALLopurinol（20μM）預(yù)處理30min后，加入單硝酸異山梨酯，觀察這些酶抑制對單硝酸異山梨酯上調(diào)CGRPmRNA表達(dá)的影響。 結(jié)果：

15、（1）與GSTM1野生型個體相比，GSTM1缺失型個體SBP于服藥后多個時間點均顯著降低且恢復(fù)時間顯著延長，GSTM1缺失個體服藥后DBP顯著低于GSTM1野生型個體且持續(xù)時間也顯著延長。GSTM1缺失型與野生型個體間服藥后心率變化存在顯著差異；（2）GSTM1缺失型個體服藥后單硝酸異山梨酯Cmax和AUC0→∝均明顯低于GSTM1野生型個體；（3）服藥后血漿CGRP濃度顯著升高，GSTM1缺失型個體血漿CGRP濃度升高時間早于GSTM

16、1野生型個體，且CGRP濃度升高持續(xù)時間顯著長于GSTM1野生型個體，GSTM1缺失型個體血漿CGRP濃度升高的百分率也顯著高于GSTM1野生型個體；（4）志愿者口服單硝酸異山梨酯后，在第10，11，12小時，其服藥前XORmRNA水平與ASBP呈明顯的正相關(guān)；（5）服藥后7小時GSTM1缺失型個體外周血單個核細(xì)胞CGRPⅠmRNA表達(dá)顯著增高（p<0.05），而GSTM1野生型個體CGRPⅠmRNA表達(dá)變化不明顯；（6）單硝酸異山梨酯