新型二聚體蝎型探針定量檢測沙眼衣原體方法的建立.pdf

1、目的：目前，沙眼衣原體(CT)檢測的方法為基于Taqman探針技術(shù)的熒光定量PCR，該法具有敏感度高和特異性好等優(yōu)點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于臨床。但是，Taqman探針技術(shù)存在以下兩大問題：一是由于探針兩端同時(shí)標(biāo)記熒光染料，所以合成和純化成本較高；二是檢測過程需要三步：變性、雜交、延伸水解，檢測時(shí)間較長。二聚體蝎型探針分別標(biāo)記熒光染料于互補(bǔ)的兩段單鏈DNA上，從原理上克服了Taqman探針標(biāo)記和純化難度大等缺點(diǎn)而降低了成本；在檢測步驟上省去了酶水解

2、過程，可縮短檢測時(shí)間。本研究擬建立一種快速、準(zhǔn)確、價(jià)廉、操作簡便，以二聚體蝎型探針熒光定量PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的檢測CT方法。 方法：采用基因克隆技術(shù)，將CT保守序列主要外膜蛋白基因(MOMP)克隆入pMD18-T載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒作為DNA標(biāo)準(zhǔn)品。根據(jù)MOMP基因序列設(shè)計(jì)二聚體蝎型探針，優(yōu)化定量PCR體系。采用4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品系列和1個(gè)陽性標(biāo)本，對其批內(nèi)變異系數(shù)(CV)和批間變異系數(shù)進(jìn)行測定；采用肺炎衣原體、鸚鵡熱衣原體、15種標(biāo)準(zhǔn)血清

3、型CT及16種生殖道常見病原體對其特異性進(jìn)行測定；用該檢測系統(tǒng)與兩種FDA認(rèn)證的分子診斷方法，分別對148例臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測，根據(jù)CT診斷的“擴(kuò)大金標(biāo)準(zhǔn)”，三種方法中任何兩種方法陽性即判為該標(biāo)本為CT感染標(biāo)本，對本檢測方法的臨床檢測性能進(jìn)行評價(jià)。 結(jié)果：1)成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒。2)建立了基于二聚體蝎型熒光探針的熒光定量PCR方法，其線性范圍為25～1010 copies/反應(yīng)管；不同濃度樣本的批內(nèi)CV范圍為4.92％～21.73