血紅素加氧酶-一氧化碳系統(tǒng)在復發(fā)緩解型實驗性自身免疫性腦脊髓炎中的作用及機制.pdf

1、目的：多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）是一種以中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）白質(zhì)脫髓鞘為主要病理特點的自身免疫性疾病。其確切病因及發(fā)病機制目前尚未闡明，較公認的觀點認為MS與環(huán)境、遺傳、感染因素有關。因此通過建立動物模型，探討MS的發(fā)病機制，尋求有效的治療方案，是目前研究的主要方向。
　　 越來越多的證據(jù)表明，氧化應激在MS的動物模型.實驗性自身免疫性腦脊髓炎（exp

2、erimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）的中起重要作用。氧化應激是多種不同疾病發(fā)病的根本機制，與許多神經(jīng)疾病有關。氧化損傷在EAE中非常重要，因為中樞神經(jīng)系統(tǒng)，尤其是少突膠質(zhì)細胞，對氧化損傷非常敏感。機體中存在大量的內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)以對抗氧化應激損傷。血紅素加氧酶（heme oxygenase，HO）就是其中之一。HO-1是一種氧化應激誘導下的熱休克蛋白，可以催化血紅素分解生成一氧化碳（ca

3、rbon monoxide，CO）和抗氧化劑膽綠素，后者是多種疾病情況下抗自由基的主要防御機制。HO-1可以被熱休克和氧化應激等多種刺激因素誘導，在多種病理條件下發(fā)揮其抗自由基的內(nèi)源性保護機制，如炎癥、缺血性發(fā)作和多種神經(jīng)變性疾病。但是，只有很少的研究報道過HO-1在EAE中的表達，而且其在EAE中的作用也不清楚。
　　 本實驗旨在檢測HO-1在EAE中的誘導表達，探討HO-1/CO系統(tǒng)在EAE發(fā)病中的影響。通過抗氧化劑-硫辛酸

4、和血紅素氧合酶抑制劑-錫原卟啉對EAE大鼠的干預來觀察其對脫髓鞘疾病的治療作用，同時通過基因芯片技術檢測與發(fā)病相關的基因。
　　 方法：
　　 1.動物分組：將100只成年健康雌性Wistar大鼠，體重180～200 g，隨機分出正常對照組6只，其余動物用新鮮豚鼠全脊髓勻漿（GPSCH）誘導免疫，待動物第一次發(fā)病后隨機選出發(fā)病組大鼠6只，其余平均分為EAE組、地塞米松組（DXM組，2 mg·kg-1·d-1）、硫辛酸組（

5、LA組，100 mg·kg-1·d-1）、錫原卟啉組（SNPP組，loo μ mol·kg-1·d-1）。其中EAE和各藥物干預組再按病程分為緩解、復發(fā)兩個亞組，每亞組6只（藥物干預組動物無復發(fā)者，按預實驗中統(tǒng)計的EAE組動物緩解復發(fā)平均天數(shù)分為干預后7天組和干預后14天組）。
　　 2.模型制備：將新鮮豚鼠全脊髓制成勻漿，加上完全福氏佐劑（complete Freund's adjuvant，CFA），佐劑中所含卡介苗6mg/

6、ml，經(jīng)過乳化后按0.5 ml/只分別于大鼠四肢足墊和背部皮下注射。藥物治療組于動物發(fā)病后（神經(jīng)功能評分達2分）第一天起給予相應劑量腹腔注射，連續(xù)注射7天。
　　 3.神經(jīng)功能評分：于免疫誘導當日及免疫后每天對動物的體重變化、精神狀態(tài)、活動情況進行觀察，并對動物進行神經(jīng)功能評分，采用國際通用的Kono評分標準，分為5分：0分正常；1 分動物尾部無力；2 分尾部無力+肢體無力；3 分肢體輕度麻痹；4 分肢體嚴重麻痹，被動翻身后不能

7、復原；5.分瀕死狀態(tài)或死亡。
　　 4.組織病理學：在動物麻醉狀態(tài)下，快速取其脊髓中腰膨大處組織，4％多聚甲醛固定，石蠟包埋，組織切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察炎癥細胞浸潤情況。
　　 5.免疫組織化學染色：取動物脊髓腰膨大處組織，石蠟包埋，做6 μ m橫截面切片，血清封閉，加HO-1一抗，經(jīng)二抗、三抗孵育，DAB顯色，蘇木精復染，脫水透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察HO-1表達情況。
　　 6.脊髓組織中

8、cGMP的測定：動物麻醉狀態(tài)下，迅速取脊髓腰膨大處組織研磨勻漿，離心，收集上清液，60℃烤箱中烘干，殘渣存放于4℃冰箱中批量測定。采用放射免疫法檢測cGMP含量。
　　 7.血清中MDA、SOD的測定：動物麻醉狀態(tài)下，快速心臟穿刺取血2-3ml離心分離血清，標本置于-20℃冰箱內(nèi)批量測定。MDA用硫代巴比妥酸法，SOD用黃嘌呤氧化法測定。
　　 8.信號轉導通路發(fā)現(xiàn)者基因芯片檢測：取各組大鼠的脊髓腰膨大處新鮮組織，提取R

9、NA，逆轉錄反應生成cDNA，標記探針，與芯片雜交，加入鏈親和素耦聯(lián)的堿性磷酸酶（AP）及化學發(fā)光底物反應。圖像采集，數(shù)據(jù)分析。
　　 結果：
　　 1.動物復發(fā)情況觀察：EAE組動物復發(fā)率66.7％，LA組動物復發(fā)率33.3％，DXM組和SNPP組動物均無復發(fā)。DXM組、LA組、SNPP組復發(fā)率均小于EAE組，有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。LA組與DXM組、SNPP組之間無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　 2

10、.動物行為學觀察：在動物緩解期（發(fā)病后第7天）和復發(fā)期（發(fā)病后第14天）時神經(jīng)功能評分比較：（1） 緩解期：DXM組、LA組、SNPP組評分均小于EAE組，有統(tǒng)計學意義（P<0.05），DXM組、LA組和SNPP組之間評分比較無統(tǒng)計學意義； （2） 復發(fā)期：LA組與EAE組評分比較無統(tǒng)計學意義（P>0.05），DXM組和SNPP組動物均無復發(fā)。
　　 3.組織病理學觀察：發(fā)病后各組大鼠脊髓組織內(nèi)遍布“袖套樣”炎性細胞浸潤，以灰白

11、質(zhì)交界區(qū)較多，浸潤細胞以淋巴細胞為主，且炎性細胞數(shù)目的多少與疾病嚴重程度相一致，發(fā)病期血管“袖套”數(shù)最多，緩解期血管“袖套”數(shù)減少，細胞浸潤減輕，復發(fā)期幾乎很少見到血管袖套樣結構，但炎細胞浸潤仍很多，呈彌漫分布。緩解期DXM組、LA組、SNPP組血管袖套數(shù)目均明顯低于EAE組（P<0.01），但各藥物干預組間無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。復發(fā)期各組間血管袖套數(shù)目比較都沒有統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　 4.脊髓HO-1表達：

12、脊髓切片免疫組化染色結果顯示，發(fā)病期陽性細胞數(shù)目最多，緩解期減少，復發(fā)期陽性細胞再次增多，并主要分布在炎性細胞浸潤的血管“袖套樣”病變處，與病灶分布基本一致。SNPP組與DXM組、LA組、EAE組比較，同病期陽性細胞數(shù)減少，有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。DXM組、LA組、EAE組三組之間無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　 5.脊髓組織cGMP含量比較：動物發(fā)病期cGMP含量增加，EAE組緩解期和復發(fā)期無明顯下降，而同病期的地塞

13、米松和硫辛酸干預組cGMP含量均下降。
　　 6.血清中丙二醛（MDA）含量比較：動物發(fā)病期MDA含量增加，緩解期減少，復發(fā)期再次升高，有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。各藥物干預組與同病期EAE組比較MDA含量均減少，但無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　 7.血清中超氧化物歧化酶（SOD）含量比較：動物發(fā)病期SOD含量增加，緩解期減少均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），復發(fā)期無明顯變化。緩解期：LA組和SNPP組含量與EAE

14、組相比均升高，SNPP組更為顯著（P<0.01），DXM組與EAE組比較無明顯變化；復發(fā)期：DXM組和LA組含量與EAE組相比均升高，SNPP組反而降低。
　　 8.基因芯片分析結果：篩選出10項基因在比較中隨病程變化呈現(xiàn)出發(fā)病期表達上調(diào)，緩解期表達下調(diào)，復發(fā)期表達再次上調(diào)的趨勢，考慮與EAE發(fā)病有關。其中8項基因在DXM組中緩解期表達下調(diào)后復發(fā)期未再次上調(diào)，考慮與DXM作用有關；3 項基因在LA組中緩解期表達下調(diào)后復發(fā)期未再次

15、上調(diào)，考慮與LA作用有關；5項基因在SNPP組中緩解期表達下調(diào)后復發(fā)期未再次上調(diào)，考慮與SNPP作用有關。
　　 結論：
　　 1.硫辛酸和錫原卟啉均可以促進EAE大鼠的病情緩解，降低動物復發(fā)率，尤其錫原卟啉與地塞米松效果相似。
　　 2.錫原卟啉可以減少EAE大鼠脊髓組織HO-1的表達。
　　 3.EAE大鼠血清中MDA、SOD含量，脊髓中cGMP含量，脊髓中HO-1表達均與病情活動性相關，隨病程發(fā)展呈