日本沼蝦C型凝集素及其配體螺原體糖基化蛋白的功能研究.pdf

1、日本沼蝦（Macrobrachium nipponensis）又名青蝦或河蝦，在眾多沼蝦屬中是最有發(fā)展前途的物種之一。然而，隨著其養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，密度不斷增加，其患病的幾率也大大增加。日本沼蝦的病原種類較多，主要是細菌、病毒，引起的病害也越來越嚴重。近年來，螺原體作為一種新型的致病菌受到廣大學者的關注。中華絨螯蟹螺原體（Spiroplasma eriocheiris）能導致中華絨螯蟹（又稱河蟹）患“顫抖病”，嚴重影響了水產養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)

2、展。王文等進一步證實了中華絨螯蟹螺原體不僅是河蟹“顫抖病”的致病菌，也是克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)、南美白對蝦(Penacus vannamei)、羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)和日本沼蝦等水生甲殼動物的致病菌。日本沼蝦缺少免疫球蛋白，其防御機制完全依賴先天性免疫系統(tǒng)，C型凝集素作為一類很重要的免疫因子被大家所熟知。同時凝集素作為糖結合蛋白，可以用來篩選糖基化蛋白。本論文首先從日

3、本沼蝦中篩選了三種C型凝集素，并通過基因克隆、序列分析、體外蛋白表達以及其功能特征，研究了其免疫抗菌機制。其次通過Far-western技術篩選了三種與C型凝集素相互作用的螺原體糖基化蛋白，并對其進行體外重組表達、多克隆抗體制備，MTT細胞毒性實驗等進一步研究了凝集素的抗菌能力和在螺原體侵染過程中的作用。本論文具體的實驗研究內容將從以下三個方面開展:
　　1.C型凝集素的序列特性及功能研究
　　本部分實驗從日本沼蝦得到三種C

4、型凝集素，命名為MnCTLDcp1、MnCTLDcp2、MnCTLDcp3，通過序列分析得知這三種C型凝集素均含有特征性CTLD結構域。RT-PCR結果顯示MnCTLDcp1和MnCTLDcp2均在心臟中表達量最高，MnCTLDcp3在肝胰腺中有最高的表達量。細菌刺激后三種凝集素表達量迅速上調并且在一定時間內達到最大值，將靶基因沉默后再用嗜水氣單胞菌刺激，其表達量明顯下調，說明三種C型凝集素參與了日本沼蝦的抗菌反應。另外，體外重組表達的

5、凝集素可以凝集并結合不同的革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，這些實驗結果說明了C型凝集素在日本沼蝦的先天性免疫反應中發(fā)揮著非常重要的作用。
　　2.C型凝集素篩選螺原體糖基化蛋白
　　本實驗先提取螺原體總蛋白，經過SDS-PAGE膠分離后再轉移到PVDF膜上，再用三種重組C型凝集素分別孵育，經TMB顯色之后，與對照相比找出差異的條帶進行質譜分析，即篩選了與C型凝集素相互作用的三種螺原體糖基化修飾蛋白，分別為ATP合酶β亞基(ATP

6、 synthase subunit beta)、分子伴侶DnaK(molecular chaperone DnaK)、果糖-二磷酸醛縮酶（fructose-bisphosphate aldolase）。以篩選得到的三種螺原體糖基化蛋白為主要研究對象，對其進行基因克隆、體外原核表達，得到三種純化的重組蛋白。通過Far-western技術體外驗證了螺原體糖基化蛋白和C型凝集素的相互作用，結果顯示三種糖基化蛋白與MnCTLDcp3的結合效果最

7、好，與MnCTLDcp1的結合能力最弱。
　　3.螺原體糖基化蛋白功能特性研究
　　在本部分實驗中，選取MnCTLDcp3進行S2細胞共轉染和免疫共沉淀技術再次驗證了其與三種糖基化蛋白的相互作用，實驗結果與預想結果一致。另外，對三種螺原體糖基化蛋白進行多克隆抗體制備，并驗證了它們在細胞膜上均有大量分布。MTT細胞毒性實驗中通過用抗體將螺原體包被削減了其侵染力從而使細胞有更好的存活率，進一步驗證了螺原體侵染宿主的過程中，螺原體