十足目甲殼動物C型凝集素功能研究.pdf

1、十足目甲殼動物是重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種，可創(chuàng)造巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。但水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)長期遭受病害侵襲，研究其免疫防御機(jī)制，尤其是病原識別機(jī)制對于疾病防治具有重要意義。C型凝集素是甲殼動物中一種重要的病原識別分子，且大量表達(dá)，但目前關(guān)于其功能研究很少。為了闡明它們在針對病原時(shí)的具體作用，并研究該家族是否具有特異性，本研究選取對蝦和克氏原螯蝦為實(shí)驗(yàn)動物，研究C型凝集素在其免疫系統(tǒng)中的作用，主要是病原識別和識別后的下游免疫反應(yīng)以及C型凝集素家族的多樣性。<

2、br>　　 1.中國明對蝦C型凝集素3(FcLec3)作為病毒受體參與抗病毒免疫反應(yīng)
　　 我們在中國明對蝦中發(fā)現(xiàn)了一種新的C型凝集素命名為FcLec3。FcLec3的cDNA全長為739bp，其中開放閱讀框?yàn)?74bp，編碼一個(gè)含158個(gè)氨基酸殘基的蛋白，其中信號肽長17個(gè)殘基，另外含有一個(gè)C型凝集素樣結(jié)構(gòu)域。FcLec3特異性分布于肝胰腺的纖維細(xì)胞中。在受到鰻弧菌刺激后，F(xiàn)cLec3表達(dá)量會上升，然后恢復(fù)至正常水平;在受到

3、白斑病毒刺激后，表達(dá)呈現(xiàn)出先上升再下降再上升的趨勢。FcLec3重組蛋白可以在鈣離子存在的情況下凝集細(xì)菌，并且該凝集活性能夠被麥芽糖、N乙?；母事短前?、肽聚糖和胞壁酸抑制，說明該蛋白可以結(jié)合這些糖類。另外，我們還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)cLec3可以結(jié)合白斑病毒的最主要囊膜蛋白VP28，說明其發(fā)揮病毒受體的作用。
　　 2.中國明對蝦C型凝集素4(FcLec4)作為調(diào)理素促進(jìn)吞噬作用
　　 我們在中國明對蝦中鑒定得到一條C型凝集素，命

4、名為FcLec4。FcLec4含有信號肽和一個(gè)C型凝集素樣結(jié)構(gòu)域。盡管來自于甲殼動物，F(xiàn)cLec4與來自于昆蟲中的凝集素相似度更高。FcLec4與大部分甲殼動物C型凝集素不同，其分布較為廣泛，在鰓、胃、肝胰腺和腸中均可檢測到。受到鰻弧菌刺激后，F(xiàn)cLecA在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上均會上調(diào)表達(dá)，并且在合成后被釋放至循環(huán)系統(tǒng)中發(fā)揮作用。FcLec4可以凝集多種革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌，結(jié)合肽聚糖，并且可以選擇性地緊密結(jié)合于幾種微生物表面。在結(jié)合鰻弧菌

5、后，F(xiàn)cLec4可以在對蝦體內(nèi)促進(jìn)機(jī)體對鰻弧菌的清除作用。另外，我們還在日本囊對蝦中發(fā)現(xiàn)了FcLec4的同系物，該同系物與FcLec4的序列相似性達(dá)到94％，并且具有和FcLec4相似的表達(dá)模式。我們純化了FcLecA的天然蛋白，發(fā)現(xiàn)其同樣可以結(jié)合于鰻弧菌表面，并且在日本囊對蝦體內(nèi)加快機(jī)體對細(xì)菌的清除速率，并且這種作用不只局限于鰻弧菌，還可針對數(shù)種其他細(xì)菌。FcLec4天然蛋白還可在體內(nèi)結(jié)合于日本囊對蝦血細(xì)胞表面，說明其作為一種調(diào)理素，

6、在識別病原后，促進(jìn)血細(xì)胞對病原菌的吞噬作用。
　　 3.克氏原螯蝦C型凝集素2(PcLec2)誘導(dǎo)酚氧化酶激活系統(tǒng)的活化
　　 通過對克氏原螯蝦cDNA文庫進(jìn)行測序和分析，我們得到了一條C型凝集素PcLec2，其含有一個(gè)長為131氨基酸殘基的C型凝集素樣結(jié)構(gòu)域。PcLec2特異性地分布于肝胰腺中，在受到脂多糖和細(xì)菌刺激后，表達(dá)量會明顯上調(diào)，說明其可能參與了螯蝦的抗細(xì)菌免疫。盡管PcLec2重組蛋白不能凝集細(xì)菌和抑制其生長

7、，但可以在不依靠鈣離子的情況下結(jié)合于細(xì)菌表面，并且鈣離子可以增強(qiáng)結(jié)合活性;另外，PcLec2還可以結(jié)合脂多糖，但鈣離子并不能發(fā)揮作用。PcLec2還可以在體外和體內(nèi)誘發(fā)酚氧化酶激活系統(tǒng)的活化，并且可在體內(nèi)增強(qiáng)由細(xì)菌引發(fā)的激活作用。
　　 4.日本囊對蝦中C型凝集素表現(xiàn)出了序列多樣性和病原相對特異性
　　 通過對日本囊對蝦進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，我們共發(fā)現(xiàn)了31條可能的C型凝集素。通過對它們的序列信息進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，對維持其C型凝集

8、素樣結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)重要的氨基酸殘基如形成兩對二硫鍵的半胱氨酸、參與疏水核心形成的氨基酸等較為保守，而對底物結(jié)合比較重要的殘基顯得有較多變化，這種現(xiàn)象可能導(dǎo)致了C型凝集素功能的多樣性。大多數(shù)C型凝集素主要分布于肝胰腺和血細(xì)胞中;于肝胰腺中高表達(dá)的C型凝集素更傾向于組織特異性分布，而于其他組織中高表達(dá)的C型凝集素更傾向于廣泛分布。在受到鰻弧菌刺激后，有21個(gè)基因表達(dá)出現(xiàn)明顯變化，大多數(shù)在感染早期作用（6小時(shí)）。肝胰腺中最高表達(dá)的基因在細(xì)菌刺激后