TFG種子的殺蟲(chóng)活性和有效成分研究.pdf

1、本研究以豆科植物TFG為材料,以主要的儲(chǔ)糧害蟲(chóng)谷蠹、玉米象、雜擬谷盜、鋸谷盜為試驗(yàn)對(duì)象,對(duì)粗提物和分離物的觸殺、驅(qū)避活性進(jìn)行了跟蹤測(cè)定,系統(tǒng)研究了溶劑和提取方法對(duì)粗提物觸殺、驅(qū)避活性的影響,比較了提取率和生物活性的差異,客觀評(píng)價(jià)了與提取效率及殺蟲(chóng)活性相關(guān)的因子在提取分離過(guò)程中的作用,并確立了一種用于提取TFG生物活性物質(zhì)的最優(yōu)方案,分離出其中所含的活性成分,鑒定出其化學(xué)結(jié)構(gòu),最后進(jìn)一步研究了活性單體的作用。主要研究結(jié)果如下:
　　

2、 1.以無(wú)水乙醇、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、石油醚為溶劑采用溫浸回流法對(duì)TFG種子中的生物活性物質(zhì)進(jìn)行提取。用乙醇作溶劑時(shí),對(duì)TFG的提取率最高,為11.48％,TFG的石油醚提取率最低,只有4.91％。TFG的氯仿提取率、乙酸乙酯提取率和丙酮提取率分別為7.24％、7.54％和5.29％。
　　 生物測(cè)定結(jié)果表明:TFG的5種溶劑粗提物對(duì)玉米象成蟲(chóng)都表現(xiàn)出一定的驅(qū)避作用。氯仿溫浸粗提物對(duì)玉米象的驅(qū)避效果最好,在劑量為1000μg

3、/cm2的驅(qū)避級(jí)別達(dá)到Ⅱ級(jí),在處理劑量為5000μg/cm2時(shí),驅(qū)避級(jí)別達(dá)到Ⅲ級(jí),其次是丙酮粗提物,在處理劑量為1000μg/cm2時(shí)對(duì)玉米象的驅(qū)避級(jí)別達(dá)到Ⅱ級(jí)。
　　 2.以TFG種子干粉為原料,以無(wú)水乙醇為提取溶劑,采用冷浸法、溫浸法、索氏法、冷浸-索氏法、超臨界CO2萃取法(SCFE)對(duì)TFG粗提物的提取方法進(jìn)行了比較研究,SCFE法的提取率為11.35％,高于冷浸法(4.65％)和冷浸-索氏法(8.14％),略低于索氏法

4、(12.99％),和溫浸法(11.48％)的提取率基本持平。
　　 5種方法得到的粗提物對(duì)雜擬谷盜都表現(xiàn)出良好的驅(qū)避性,不同粗提物的有效驅(qū)避劑量差異顯著,其中,超臨界CO2萃取物試驗(yàn)所用劑量最小,由初試結(jié)果將最高劑量擬定為0.16mg/cm2,其平均的驅(qū)避率為87.9％,驅(qū)避級(jí)別為Ⅴ級(jí),第1天的驅(qū)避效果很顯著,驅(qū)避率為96.6％,到第4天仍有明顯的驅(qū)避效果；溫浸法粗提物效果也較好,當(dāng)粗提物劑量為0.96mg/cm2～1.6mg/

5、cm2,處理后每天的驅(qū)避率都超過(guò)了80％,而平均驅(qū)避率更是超過(guò)了90％,驅(qū)避級(jí)別均在Ⅴ級(jí)。冷浸法、索氏法、冷浸-索氏法得到的粗提物的驅(qū)避效果相對(duì)較差,因而測(cè)試劑量最大,最高劑量設(shè)為16mg/cm2,是超臨界CO2萃取物試驗(yàn)測(cè)試劑量的100倍。
　　 5種方法得到的各粗提物對(duì)玉米象都有較好的觸殺效果,很小的劑量即可導(dǎo)致玉米象大量死亡。通過(guò)對(duì)各個(gè)時(shí)間段所得到的致死中量進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)超臨界CO2萃取物對(duì)玉米象的觸殺效果最好,處理玉米象

6、24h、48h、72h后的致死中量分別為0.252mg/cm2、0.232mg/cm2、0.166mg/cm2,與其它方法相比,劑量均為最低。
　　 5種方法得到的各粗提物對(duì)雜擬谷盜的致死中量從小到大依次為溫浸法、SCFE法、冷浸法、冷浸.索氏提取、索氏提取法。SCFE法得到的粗提物對(duì)雜擬谷盜的觸殺活性除了在前三天的觀察中略低于溫浸法粗提物,在轉(zhuǎn)入飼料中飼喂一周后,其對(duì)雜擬谷盜的LD50與溫浸法相當(dāng),在處理劑量為0.91mg/c

7、m2時(shí),雜擬谷盜72h后的死亡率達(dá)到了90％,在劑量高于0.52mg/cm2時(shí),10d后的死亡率均在80％以上。
　　 5種方法得到的各粗提物對(duì)谷蠹的致死活性依次為溫浸法>SCFE技術(shù)>冷浸法>索氏提取法>冷浸-索氏提取法。溫浸法和SCFE法得到的TFG粗提物對(duì)谷蠹有良好的觸殺活性,處理谷蠹24h后的LD50分別為0.255mg/cm2和0.256mg/cm2,48h后的LD50分別為0.144m/cm2和0.156mg/cm2

8、,72h后的LD50分別為0.112mg/cm2和0.142mg/cm2,10d后的LD50分別為0.100mg/cm2和0.130mg/cm2。
　　 3.以3種溶劑乙醇、乙酸乙酯、氯仿作為夾帶劑,對(duì)TFG種子干粉進(jìn)行SCFE,TFG種子粗提物萃取得率由高到低的順序依次為:乙醇>乙酸乙酯>氯仿>無(wú)夾帶劑,分別為14.17％、13.31％、10.74％和10.18％。
　　 以乙醇作為夾帶劑時(shí),所得到的超臨界CO2萃取物

9、對(duì)玉米象的觸殺活性最強(qiáng),對(duì)玉米象處理24h,48h,72h后的LD50分別為231.764μg/cm2,194.43μg/cm2,141.06μg/cm2；乙酸乙酯作夾帶劑時(shí),得到的萃取物對(duì)玉米象的觸殺效果也較好,對(duì)玉米象處理24h,48h,72h后的LD50分別為228.67μg/cm2,180.09μg/cm2和152.61μg/cm2,觸殺效果較弱的是氯仿作為超臨界CO2萃取的夾帶劑時(shí)得到的萃取物,效果最差的是不選用夾帶劑,用單一

10、的超臨界CO2作為溶劑而萃取得到的萃取物,處理玉米象72h后的LD50最大,為218.74μg/cm2。
　　 不同夾帶劑萃取得到的各萃取物對(duì)雜擬谷盜成蟲(chóng)的觸殺活性的大小依次為氯仿>乙醇>無(wú)夾帶劑>乙酸乙酯,處理雜擬谷盜10d后的LD50分別為278.57μg/cm2、303.89μg/cm2、341.74μg/cm2和429.45μg/cm2。
　　 4.以萃取率作為目標(biāo)函數(shù),通過(guò)考察分析萃取壓力、萃取溫度、萃取時(shí)間、

11、夾帶劑體積和夾帶劑濃度對(duì)萃取率的影響趨勢(shì),確定超臨界CO2萃取過(guò)程中各影響因素的正交試驗(yàn)條件為:操作壓力的正交試驗(yàn)區(qū)間為20MPa～30MPa；萃取溫度的正交試驗(yàn)區(qū)間為45℃～55℃；正交試驗(yàn)的操作時(shí)間為1.5h；正交試驗(yàn)夾帶劑用量的區(qū)間為20mL～40mL；正交試驗(yàn)夾帶劑濃度的區(qū)間為60％～95％。
　　 選擇TFG萃取物的觸殺活性作為主要的評(píng)判指標(biāo),同時(shí)以TFG萃取物萃取得率作為補(bǔ)充評(píng)判指標(biāo),以正交試驗(yàn)對(duì)TFG超臨界CO2進(jìn)

12、行工藝優(yōu)化,試驗(yàn)結(jié)果表明:最佳萃取工藝為萃取壓力25Mpa,萃取溫度55℃,夾帶劑為95％乙醇,固液比為200g:30mL。
　　 5.用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水依次對(duì)TFG超臨界CO2萃取物(簡(jiǎn)稱TFG-1)進(jìn)行萃取,萃取率分別為61.32％、9.22％、9.16％、8.39％和17.08％。生物測(cè)定結(jié)果表明:TFG-1的活性成分主要存在于石油醚萃取物中,對(duì)谷蠹成蟲(chóng)表現(xiàn)出很強(qiáng)的觸殺作用,TFG-1石油醚萃取物對(duì)谷蠹處

13、理24h、48h、72h和10d后的LD50分別為175.05μg/cm2、133.65μg/cm2、113.37μg/cm2和79.34μg/cm2。氯仿萃取物對(duì)谷蠹的觸殺活性較強(qiáng),乙酸乙酯萃取物具有一定的活性,而正丁醇萃取物和水提取物未見(jiàn)殺蟲(chóng)活性。
　　 以不同極性的溶劑系統(tǒng)作為展開(kāi)劑,將TFG-1石油醚萃取物進(jìn)行薄層層析(TLC),在紫外光(254nm)下進(jìn)行觀察,未見(jiàn)明顯譜帶。說(shuō)明TFG-1石油醚萃取物沒(méi)有紫外吸收現(xiàn)象。

14、當(dāng)以石油醚:乙酸乙酯=10:1的混合溶劑作為展開(kāi)劑時(shí)展層效果最好,在碘顯色時(shí)有5個(gè)譜帶,在磷鉬酸顯色時(shí)有10個(gè)譜帶,其Rf值在0.1-0.9之間。
　　 將TFG-1石油醚萃取物進(jìn)行柱層析,第1次柱層析后,經(jīng)TLC檢測(cè),歸類(lèi)合并,共得到7個(gè)流分,第1個(gè)組分(Ⅰ)的得率最高,為75.13％,是TFG-1石油醚萃取物的主要成分。當(dāng)載藥量均為519.95μg/cm2時(shí),只有流分Ⅰ的殺蟲(chóng)效果最明顯,對(duì)谷蠹的致死率在24h時(shí)即達(dá)到100％

15、,流分Ⅵ其次,對(duì)谷蠹的致死率在24h時(shí)為80.76％,另外流分Ⅴ也有較好的殺蟲(chóng)效果,對(duì)谷蠹的致死率在24h時(shí)為46.67％,而流分Ⅱ、Ⅳ和Ⅶ的殺蟲(chóng)效果較差,流分Ⅲ幾乎沒(méi)有殺蟲(chóng)效果。
　　 流分Ⅰ柱層析分離得到5個(gè)樣品,分別為樣品a、樣品b、樣品c、樣品d、樣品e,其中樣品e為流分Ⅰ的主要成分。流分Ⅵ柱層析分離后得到4個(gè)樣品,分別為樣品f、樣品g、樣品h、樣品i,其中樣品i為流分Ⅵ的主要成分。生物測(cè)試結(jié)果顯示從流分Ⅰ中得到的5個(gè)樣

16、品均有殺蟲(chóng)活性,樣品e對(duì)谷蠹成蟲(chóng)的觸殺活性很強(qiáng),當(dāng)處理劑量為259.98μg/cm2時(shí),谷蠹經(jīng)樣品e處理后,其24h時(shí)的死亡率達(dá)77.78％。從流分Ⅵ中得到的4個(gè)樣品同樣均有殺蟲(chóng)活性,樣品i的觸殺活性較強(qiáng),谷蠹經(jīng)劑量為259.98μg/cm2的樣品i處理,其24h后的死亡率為41.11％。
　　 6.化合物Ⅰ對(duì)谷蠹成蟲(chóng)有較強(qiáng)的觸殺活性,劑量為129.99μg/cm2的藥劑處理試蟲(chóng)24h、48h、72h和10天后,谷蠹的平均死亡率

17、分別為32.22％、40.00％、56.67％和70.00％,死亡率較高?；衔铫駥?duì)玉米象有明顯的觸殺效果,用劑量為129.99μg/cm2的藥劑處理試蟲(chóng)24h、48h、72h和10天后,玉米象的平均死亡率分別為86.67％、92.22％、95.56％和100.00％,死亡率很高。
　　 化合物Ⅱ?qū)润己陀衩紫蟮挠|殺效果相對(duì)較弱,當(dāng)藥膜劑量為259.98μg/cm2時(shí),對(duì)谷蠹處理10天后有少量成蟲(chóng)死亡,平均死亡率為4.44％,同