中國(guó)三黃雞可溶性B淋巴細(xì)胞刺激因子的克隆、表達(dá)和活性研究.pdf

1、B淋巴細(xì)胞刺激因子BAFF(B cell activating factor belonging to the TNF family)，是一種B淋巴細(xì)胞的共刺激因子；屬TNF超家族成員。Schneider et al．(2004)成功克隆了雞BAFF基因，國(guó)內(nèi)對(duì)雞BAFF的研究尚未起步。中國(guó)三黃雞是中國(guó)常見(jiàn)的地方品種雞，本研究根據(jù)GenBank提供的雞BAFF基因序列(GenBank索取號(hào)AF506010)，設(shè)計(jì)引物，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶

2、鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，首次從中國(guó)三黃雞脾組織細(xì)胞中分別擴(kuò)增得到864bp的雞B淋巴細(xì)胞刺激因子(CycBAFF)基因和459bp的雞可溶性B淋巴細(xì)胞刺激因子(CycsBAFF)基因片段，一方面通過(guò)大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)了CycsBAFF蛋白，并對(duì)其進(jìn)行純化，Western blot，復(fù)性和活性的鑒定；另一方面，利用巴斯德畢赤酵母(pichiapastoris)成功構(gòu)建了重組CycsBAFF真核表達(dá)載體，為真核表達(dá)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。此外，我們還制備了兔抗Cy

3、csBAFF多克隆抗體，通過(guò)間接ELISA方法檢測(cè)了其效價(jià)，以及Western blot檢測(cè)其與抗原的結(jié)合性。 1.CycsBAFF的原核表達(dá)和活性研究將CycsBAFF片段克隆入原核表達(dá)載體pET-28a，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)后高效表達(dá)了帶有His<,6>標(biāo)簽的包涵體形式重組蛋白，通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳及免疫轉(zhuǎn)印檢測(cè)鑒定。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni<'2+>-NTA純化后，經(jīng)透析復(fù)性得到活性目的蛋白，通過(guò)單獨(dú)刺激以及與PMA共刺

4、激體外培養(yǎng)的雞法氏囊B細(xì)胞，經(jīng)MTT法檢測(cè)，均有明顯的促法氏囊B細(xì)胞存活的效應(yīng)。 2.CycsBAFF真核表達(dá)載體的構(gòu)建將擴(kuò)增得到的CycsBAFF片段與畢赤酵母表達(dá)載體進(jìn)行連接，得到重組載體 pPIC9-CycsBAFF，線(xiàn)性化后轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞GSll5。 3.兔抗CycsBAFF多克隆抗體的制備及鑒定通過(guò)皮下注射重組CycsBAFF蛋白，制得抗CyesBAFF多克隆抗體，間接ELISA法檢測(cè)抗血清效價(jià)為20000倍；并