IKKβ-FOXO3a-VEGF信號通路在As2O3抑制血管生成中的作用和機制研究.pdf

1、目的：As2O3抑制血管生成的相關機制尚未清楚，F(xiàn)OXO3a轉錄因子在血管生成中起相關作用。本研究通過觀察FOXO3a在As2O3抑制血管生成中的作用，分析探討IKKβ、FOXO3a、VEGF三者之間的關系，闡明As2O3抑制血管生成的分子機制。
　　方法：以人乳腺癌MCF-7細胞、人臍靜脈內(nèi)皮HUVECs細胞為實驗對象，利用siRNA瞬時轉染方法改變FOXO3a的表達，利用CCK-8方法檢測內(nèi)皮細胞增殖情況，transwell方

2、法檢測內(nèi)皮細胞遷移數(shù)目，matrigel實驗檢測內(nèi)皮細胞體外小管形成情況，Western blot方法、免疫細胞化學方法、RT-PCR分別在蛋白和mRNA水平檢測不同處理情況下IKKβ、FOXO3a、VEGF的表達。
　　結果：第一部分：1.CCK-8檢測(1)與FOXO3a siRNA組(13.7％±11.0％)相比，As2O3組、control siRNA組對HUVECs細胞體外增殖的抑制率分別為45.8％±9.0％、42.6

3、％±11.0％(P<0.05)。(2)與CM FOXO3a siRNA組(28.1±11.5％)相比，CM As2O3組、CM control siRNA組HUVECs細胞體外增殖的抑制率分別為61.7％±11.5％、58.9％±15.6％(P<0.05)。2.Transwell結果顯示，(1)與control組(189.92±45.60)相比，As2O3組、control siRNA組、FOXO3a siRNA組(87.67±21.6

4、8，108.01±10.63，123.08±12.50)HUVECs細胞遷移數(shù)目減少(P<0.05)；FOXO3a siRNA組細胞遷移數(shù)目較control siRNA組多(P<0.05)；(2)與CMcontrol組(206.92±12.02)相比，CM As2O3組、CM control siRNA組、CM FOXO3asiRNA組(77.83±8.93，98.50±10.83，162.50±23.27)內(nèi)皮細胞遷移數(shù)目減少(P<0

5、.05)，CM FOXO3a siRNA組細胞遷移數(shù)目較CM control siRNA組多(P<0.05)。3.Matrigel結果顯示，(1)與control組(19.81±3.12)相比，As2O3組、control siRNA組、FOXO3a siRNA組(3.38±2.19，7.25±1.95，14.81±2.08)小管形成數(shù)目減少(P<0.05)；FOXO3a siRNA組較control siRNA組小管形成數(shù)目增加(P<

6、0.05)；(2)與CM control組(24.69±1.15)相比，CM As2O3組、CMcontrol siRNA組、CM FOXO3a siRNA組(5.25±1.72，4.81±1.83，14.06±1.60)小管形成數(shù)目減少(P<0.05)，CM FOXO3a siRNA組較CM control siRNA組小管數(shù)目增加(P<0.05)。4.Western blot結果顯示(1)與control組相比，As2O3組FOXO

7、3a蛋白表達增加(P<0.05)，F(xiàn)OXO3a siRNA組FOXO3a蛋白表達減少(P<0.05)；CM As2O3組HUVECs FOXO3a蛋白較CM control組表達增加(P<0.05)；CM FOXO3a siRNA組FOXO3a蛋白表達降低(P<0.05)。第二部分：1.western blot結果顯示：(1)IKKβ激動劑作用下IKKβ蛋白表達量明顯增加，而FOXO3a蛋白表達量減少，經(jīng)相關分析顯示兩者之間存在負性調節(jié)

8、關系(r=-0.48，P<0.05)；(2)不同處理組FOXO3a蛋白與VEGF蛋白表達結果分析顯示二者存在負性調節(jié)關系(r=-0.86，P<0.05)；(3)給予IKKβ激動劑作用后VEGF蛋白表達量增加。2.RT-PCR結果與Western blot實驗結果相符，證實各因子的表達在mRNA水平與蛋白水平相一致。3.免疫細胞化學結果顯示，(1)As2O3作用后HUVECs細胞及MCF-7細胞胞核內(nèi)FOXO3a蛋白表達增加著色加深，F(xiàn)O

9、XO3a干擾后著色變淺，TNF-α刺激后FOXO3a胞核著色變淺。(2)As2O3作用后胞質IKKβ表達減少著色變淺，TNF-α刺激后胞質IKKβ著色變深。(3)As2O3作用后胞質VEGF蛋白表達減少著色變淺，F(xiàn)OXO3a siRNA組胞質VEGF著色變深，TNF-α刺激后胞質VEGF著色變深。
　　結論：1.FOXO3a轉錄因子參與了As2O3抑制血管生成過程；2.As2O3可以通過下調IKKβ的表達使FOXO3a因子表達上調