枸杞多糖的制備及其活化巨噬細胞機理的研究.pdf

1、枸杞是我國重要的植物資源,尤其以寧夏枸杞最為著名.現(xiàn)代醫(yī)學(xué)臨床研究認為,從枸杞中提取的枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharides,LBPs)是枸杞生物學(xué)作用的主要有效成份之一,它由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖和木糖等6種單糖組成.枸杞多糖具有延緩衰老,抗氧化;抗腫瘤,促進腫瘤細胞凋亡;降血糖,降血脂;免疫調(diào)節(jié)和抗輻射等生物學(xué)功能. 巨噬細胞是機體重要的免疫細胞,具有抗感染、抗腫瘤和免疫調(diào)

2、節(jié)等重要作用.激活的巨噬細胞除了可以直接殺傷病原微生物,清除凋亡細胞和突變細胞外,其分泌的腫瘤壞死因子-a(17NF-a)、白介素.1(IL-1)、白介素-6(IL-6)、粒一巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、一氧化氮(NO)等免疫活性分子在先天性免疫防御和獲得性免疫應(yīng)答中更是起著不可忽視的作用. 本課題主要研究枸杞多糖激活巨噬細胞的分子機制,具體分為兩個部分,第一部分以寧夏中寧枸杞為原料,采用熱水浸提法制得枸杞浸提液,運用

3、超濾法分級分離枸杞多糖,得到不同分子量范圍的三個多糖級分,硫酸苯酚法測定糖含量后,以RAW264.7細胞NO,TNF-a及GM-CSF的釋放量為指標(biāo),觀察三個級分對巨噬細胞的活化作用. 實驗結(jié)果表明:100g枸杞經(jīng)脫脂,熱水浸提,脫色,除蛋白,超濾得分子量范圍5KD.30KD、30KD-50KD、大于50KD三個級分枸杞多糖,質(zhì)量分別為2.6g、2.0g、3.2g,硫酸苯酚法測定糖含量分別為74.3﹪,69.8﹪,78.4﹪.G

4、riess法測NO產(chǎn)量及ELISA法測細胞因子結(jié)果顯示:分子量5KD-30KD、30KD-50KD、大于50KD三個級分枸杞多糖均能不同程度地促進巨噬細胞分泌NO,后兩者還能促進巨噬細胞分泌TNF-a及GM-CSF. 本試驗得出的結(jié)論:超濾法可以簡單、快速、有效地對枸杞多糖進行分離,所得的5KD-30KD、30KD-50KD、大于50KD三個級分對RAW264.7細胞均有不同程度活化作用,其中以大于50KD級分作用最為顯著.

5、 第二部分以小鼠單核/巨噬類細胞RAW264.7為研究對象,觀察從美國泛華公司購買的枸杞多糖作用于巨噬細胞對其釋放細胞因子NO以及iNOS活性水平的影響,并初步探討了Toll樣受體4(TLR4)/核轉(zhuǎn)錄因子-kappa B(NF-κB)信號通路在這過程中的作用,旨在部分解釋枸杞多糖對免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)作用的機制,為其在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用提供理論依據(jù).實驗中采用Griess還原法研究枸杞多糖對巨噬細胞釋放NO的作用以及NF-κB抑制劑和TLR4抗

6、體對枸杞多糖誘導(dǎo)巨噬細胞釋放NO作用的影響,用誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)檢測試劑盒測定胞質(zhì)內(nèi)iNOS的活性,Western blot法檢測細胞核內(nèi)NF-κB的變化. 通過實驗發(fā)現(xiàn)用200μg/ml劑量的枸杞多糖作用于RAW264.7細胞6h即可明顯誘導(dǎo)NO的生成,6～18h之間NO釋放的速度迅速增加,24h后NO的釋放開始減少.實驗中以單純用全細胞培養(yǎng)液孵育的巨噬細胞作為陰性對照,以10μg/ml的脂多糖予以刺激的細胞作為陽

7、性對照組.以10、50、200、500μg/ml劑量的枸杞多糖分別作用于RAW264.7細胞18h,可以觀察到與對照組相比,10μg/ml枸杞多糖即能明顯誘導(dǎo)巨噬細胞NO的產(chǎn)生,且隨著劑量的增加,NO的產(chǎn)量不斷增加,iNOS的活性不斷增強.用TLR4抗體預(yù)孵育RAW264.7細胞1h,更換培養(yǎng)液后再加200μg/ml枸杞多糖予以刺激18h,發(fā)現(xiàn)TLR4抗體能抑制枸杞多糖誘導(dǎo)的RAW264.7細胞NO的產(chǎn)生.Western blot結(jié)果顯

8、示200μg/ml枸杞多糖作用于RAW264.7細胞6h,胞核內(nèi)p65的含量明顯增加,8h時達到高峰,10h活化程度開始減弱.另外,NF-κB抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(PDTC)作用于RAW264.7細胞90min,然后加入200μg/ml劑量的枸杞多糖對巨噬細胞進行刺激,發(fā)現(xiàn)PDTC在各個時間點(6、12、18、24h)都明顯抑制枸杞多糖對巨噬細胞釋放NO的誘導(dǎo)作用.實驗結(jié)果還顯示LPS的特殊抑制劑多粘菌素B(PMB)與枸杞多糖聯(lián)