系膜細胞活化模型的建立及其對單核巨噬細胞的生物學(xué)效應(yīng).pdf

1、目的:探討人腎臟系膜細胞（Human mesangial cells，HMCs）的活化最佳條件和HMCs活化的細胞表型和分子標志，以及活化后的HMCs對人單核巨噬細胞(Human monocyte macrophages cells，HMMCs)產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)。
　　方法:1.人HMCs的活化研究及活化后的細胞表型和分子標志研究:用10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml的重組人血小板源性生長因子(Recombinant

2、Human PlateletDerived Growth Factor-BB，PDGF-BB)分別刺激HMCs2h、6h、12h、24h、48h、72h，實時熒光定量核酸擴增檢測系統(tǒng)技術(shù)(Real-time Quantitative PCR DetectingSystem，qPCR)尋找并確定最佳刺激濃度和時間;細胞計數(shù)(Cell Counting K-8，CCK-8)檢測HMCs活化后的增殖能力;細胞劃痕實驗(Cell Scratch

3、 Test)測定HMCs活化后的趨化及遷徙能力;免疫熒光染色技術(shù)(ImmunofluorescenceStaining)檢測活化后的HMCs的Desmin、a-SMA、PDGFR-β、Transgelin、Tensin表達情況，并利用qPCR技術(shù)檢測HMCs處于活化高表達狀態(tài)下可以持續(xù)的時間。
　　2.活化的人腎系膜細胞對人單核巨噬細胞的生物學(xué)效應(yīng):用qPCR方法檢測PDGF-BB刺激后的HMCs是否可以分泌誘導(dǎo)HMMCs活化的細

4、胞因子以及有無分泌HMMCs活化的分子標志;將PDGF-BB誘導(dǎo)的的HMCs與HMMCs置于Transwell系統(tǒng)中進行共培養(yǎng)，選取2h、6h、12h、24h、48h、72h時間節(jié)點，研究活化后的HMCs對HMMCs的生物學(xué)效應(yīng);CCK-8檢測共培養(yǎng)后HMMCs的增殖能力，細胞劃傷實驗檢測共培養(yǎng)后HMMCs的趨化和遷徙能力。
　　結(jié)果:1.人HMCs的活化以及活化后的細胞表型和分子標志:(1)qPCR技術(shù)檢測不同濃度刺激下的不同時

5、間點的HMCs活化后的細胞因子IL-1、IL-6、CCL-2、PDGFR-β、Transgelin、TensinmRNA表達情況結(jié)果顯示:當使用濃度為20ng/ml的PDGF-BB刺激HMCs時，效果最為明顯，且于刺激48h的時候觀察細胞因子分泌情況效果最佳并且最為顯著，72h時觀察反而有一個回落趨勢，說明HMCs活化于48h的時候出現(xiàn)頂峰。(2)不同濃度的PDGF-BB刺激HMCs后細胞的增殖能力:細胞計數(shù)和CCK-8均顯示:加入PD

6、GF-BB刺激的HMCs相比較于空白對照組，均在20ng/ml濃度的PDGF-BB刺激下增殖最為明顯(p＜0.05)。(3)活化后的HMCs的的遷徙能力變化:分別于六孔板內(nèi)劃傷20ng/ml的PDGF-BB刺激48h后的HMCs和對照組，結(jié)果顯示實驗組的細胞最后剩余的傷痕面積明顯少于對照組，面積計算有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。(4)細胞活化表型的蛋白質(zhì)學(xué)改變:免疫熒光染色顯示，活化表型Desmin、a-SMA、PDGFR-β、Tran

7、sgelin、Tensin表達量與對照組相比均有增強，NF-kB的核內(nèi)轉(zhuǎn)運也明顯強于對照組。(5)HMCs處于活化高表達狀態(tài)下可以持續(xù)的時間:HMCs于48h的時候處于活化高表達的最高峰，以48h為基點，qPCR檢測技術(shù)顯示這種活化狀態(tài)一直到在此之后的48h才逐漸趨于沒有。
　　2.活化的人腎系膜細胞與人單核巨噬細胞的生物學(xué)效應(yīng):(1) PDGF-BB刺激HMCs細胞可以分泌促使HMMCs活化的細胞因子TNF和IL-4，而不會分泌

8、HMMCs活化的分子標志CCL-0和CCL-15和CCL-17。(2)活化的HMCs和HMMCs共培養(yǎng):共培養(yǎng)狀態(tài)下的HMMCs不分泌CCL-17（抑炎型），而會分泌CCL-15(M1型)和CCL-1（調(diào)節(jié)型）并在24h的時候達到最高。(3)與活化的HMCs共培養(yǎng)后的HMMCs細胞的增殖能力和遷徒趨化能力都明顯高于未共培養(yǎng)的HMMCs(P＜0.05)。
　　結(jié)論:1.PDGF-BB刺激HMCs并可以致其活化的最佳濃度和最佳時間分別

9、是20ng/ml和刺激48h，在此條件下，HMCs的增殖和遷徙能力都達到最高點(p＜0.05)，免疫熒光也表明各種分子標志和細胞表型都在此時表達量最高。此種活化狀態(tài)在逐漸變?nèi)醯那闆r下仍然可以維持大約48h，充足用于刺激并活化HMMCs。2.活化的HMCs可以分泌誘導(dǎo)HMMCs活化的細胞因子而不會分泌HMMCs活化的細胞表型和分子標志，可以排除后期共培養(yǎng)時的假陽性結(jié)果。共培養(yǎng)24h HMMCs的細胞表型表達量最高，活化后的HMCs只會刺激