諾帝對(duì)HPV16亞基因永生化人宮頸上皮細(xì)胞的作用.pdf

1、第一部分 目的：研究諾帝(Nordy)對(duì)HPV16型亞基因(E6、E7)永生化人宮頸上皮細(xì)胞(H8細(xì)胞)增殖，分化和凋亡的影響作用及機(jī)制。 方法：MTT法檢測(cè)諾帝對(duì)H8細(xì)胞增殖的抑制作用；免疫細(xì)胞化學(xué)SP法檢測(cè)微小染色體維持蛋白(minichromosome maintenance MCM)mcm5的表達(dá)；流式細(xì)胞術(shù)(FCM)和Annexin V-FITC法分析細(xì)胞周期和凋亡；光鏡、電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。 結(jié)果：

2、①10umol/L、50umol/L、75 umol/L和100umol/L濃度的諾帝能夠不同程度地抑制H8細(xì)胞增殖，且這種抑制作用呈劑量-時(shí)間依賴方式。②免疫細(xì)胞化學(xué)顯示經(jīng)100umol/L諾帝處理72h后，H8細(xì)胞核內(nèi)mcm5蛋白表達(dá)明顯減弱。③FCM結(jié)果顯示：10 umol/L、50 umol/L、75 umol/L、100 umol/L的諾帝處理H8細(xì)胞72h后，與對(duì)照組相比，G0/G1期細(xì)胞數(shù)明顯增加，S期和G2/M期細(xì)胞數(shù)明

3、顯減少，并呈濃度依賴性，諾帝作用后H8細(xì)胞的增殖明顯受到抑制，細(xì)胞被阻滯在G0/G1期。用100 umol/L和200umol/L諾帝處理H8細(xì)胞48h后，用Annexin V-FIIC法分析，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率(分別為12.322±0.786％和24.330±3.228％)明顯高于對(duì)照組細(xì)胞的凋亡率(3.478±1.519％)，差異具有顯著性，這提示一定濃度的諾帝可以促進(jìn)H8細(xì)胞凋亡的發(fā)生。④光鏡下觀察，諾帝作用H8細(xì)胞后，可見

4、細(xì)胞體積變小且較規(guī)則，核分裂像明顯減少，核/質(zhì)比例下降。電鏡觀察細(xì)胞核變小變規(guī)則，異染色質(zhì)增多，核逐漸成熟，成熟的線粒體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器增多，細(xì)胞形態(tài)朝良性方向分化。同時(shí)細(xì)胞凋亡增多，出現(xiàn)明顯的凋亡小體。 結(jié)論：諾帝具有抑制H8細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡，誘導(dǎo)其分化作用，這種作用可能是通過諾帝抑制H8細(xì)胞在S期進(jìn)行DNA合成，使細(xì)胞增殖受阻于G<,0>/G<,1>期，同時(shí)降低mcm5蛋白活性的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。 第二部分 目

5、的：研究諾帝(Nordy)對(duì)永生化人宮頸上皮細(xì)胞(H8細(xì)胞)HPV16 E6基因的抑制作用和機(jī)制。 方法：免疫細(xì)胞化學(xué)SP法檢測(cè)諾帝作用前后H8細(xì)胞E6蛋白和P53蛋白表達(dá)；RT-PCR檢測(cè)諾帝作用前后HPV16E6 mRNA的表達(dá)情況。 結(jié)果：①免疫細(xì)胞化學(xué)顯示，E6和P53蛋白在對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)呈陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性物分別位于胞漿和胞核，經(jīng)100umol/L諾帝處理72h后，H8細(xì)胞E6蛋白和P53蛋白表達(dá)明顯減弱，與對(duì)照組相

6、比，差異有顯著性。②用濃度10umol/L、50umol/L、100umol/L、200umol/L諾帝處理H8細(xì)胞72小時(shí)后，濃度為10umol/L的諾帝作用后H8細(xì)胞的HPV 16E6 mRNA的表達(dá)量與對(duì)照組的表達(dá)量無(wú)明顯差異，而較高濃度的諾帝(50umol/L，100umol/L，200umol/L)處理H8細(xì)胞72小時(shí)后H8細(xì)胞的HPV16E6 mRNA的表達(dá)量相比對(duì)照組有明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。