活性氧對(duì)腎細(xì)胞癌多藥耐藥基因表達(dá)的雙相調(diào)節(jié)作用.pdf

1、前言：腎細(xì)胞癌是成人腎臟病變中最常見的一種惡性腫瘤，約占全身腫瘤的2％-3％。因?yàn)橄忍煨远嗨幠退?，腎細(xì)胞癌對(duì)葸環(huán)類、長(zhǎng)春花堿類、及其它抗腫瘤藥物均不敏感。腎細(xì)胞癌的多藥耐藥性是由多藥耐藥基因(mdr1)編碼的多藥耐藥蛋白(P-glycoprotein，P-gp)過度表達(dá)所致。目前發(fā)現(xiàn)的P-gp抑制劑由于較大的毒付作用而難以應(yīng)用于臨床。因此，應(yīng)當(dāng)尋找更為有效而低毒的逆轉(zhuǎn)方法來克服腫瘤的多藥耐藥?；钚匝?ROS)是生物體有氧代謝產(chǎn)生的一類活

2、性含氧化合物的總稱，主要包括超氧陰離子(O<,2>·<'->)，羥自由基(·OH)，以及過氧化氫(H<,2>O<,2>)和單線態(tài)氧(<'1>O<,2>)等，這些物質(zhì)具有較強(qiáng)的氧化能力。過去ROS被認(rèn)為只是一類損傷細(xì)胞的毒性物質(zhì)，隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)ROS在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起著重要的的作用。而新近的研究表明，P-gp的表達(dá)受到細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的。影響，能夠被ROS所調(diào)節(jié)。因?yàn)橐恍┙Y(jié)構(gòu)和功能迥異的mdr1誘導(dǎo)因子如：表皮生長(zhǎng)因子(E

3、GF)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、阿霉素(doxorubicin)、苯并芘(benzo[a]pyrene)或紫外線作用于細(xì)胞時(shí)都要產(chǎn)生ROS(包括：超氧陰離子、羥自由基、過氧化氫)，由此推測(cè)ROS可能是它們調(diào)節(jié)mdr1基因和P-gp蛋白的共同通路。Warterlberg等已經(jīng)證實(shí)在培養(yǎng)的人前列腺腫瘤多細(xì)胞團(tuán)中內(nèi)源性H<,2>O<,2>能夠調(diào)節(jié)P-gp蛋白的表達(dá)。另有作者發(fā)現(xiàn)高水平ROS造成的氧化應(yīng)激能夠上調(diào)多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)

4、的表達(dá)。 目的：選擇P-gp過表達(dá)的腎癌細(xì)胞系A(chǔ)CHN及786-0作為MDR實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停瑱z測(cè)外源性活性氧H<,2>O<,2>對(duì)細(xì)胞增殖的影響，探討H<,2>O<,2>是否能夠調(diào)節(jié)腎癌細(xì)胞mdr1基因的表達(dá)，以進(jìn)一步研究多藥耐藥的活性氧機(jī)制，尋求新的逆轉(zhuǎn)策略。 方法： 1，ACHN及786-0細(xì)胞用不同濃度的外源性H<,2>O<,2>孵育后WST-1細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)法檢測(cè)H<,2>O<,2>對(duì)細(xì)胞增殖的影響，同

5、法檢測(cè)計(jì)算阿霉素、長(zhǎng)春新堿對(duì)兩種細(xì)胞的IC50值，觀察H<,2>O<,2>對(duì)化療藥物細(xì)胞毒性的影響。 2，以實(shí)時(shí)熒光定量RT PCR法定量檢測(cè)H<,2>O<,2>對(duì)mdr1 mRNA基因表達(dá)的作用，目的基因上游引物序列：5’CCTGTACGCCAACACAGTGC 3’，下游引物序列：5’ATACTCCTGCTTGCTGATCC 3’。 3，蛋白質(zhì)印跡分析檢測(cè)H<,2>O<,2>對(duì)P-gp表達(dá)的影響。 4．羅丹明

6、123的蓄積和外排實(shí)驗(yàn)測(cè)定P-gp功能。 結(jié)果： 1，低濃度H<,2>O<,2>(0.00001mM-0.1mM)，具有促細(xì)胞增殖作用，而高濃度H<,2>O<,2>(0.1mM以上)呈現(xiàn)濃度依賴的細(xì)胞毒性。兩種作用都呈時(shí)間依賴性，在作用72小時(shí)后，0.01、0.02、0.04mM濃度下的最大促細(xì)胞生長(zhǎng)作用最為明顯，0.1、0.2、0.4mM濃度下的抑制作用在72小時(shí)最顯著。H<,2>O<,2>聯(lián)合阿霉素、長(zhǎng)春新堿孵育72

7、小時(shí)后，0.005、0.01、0.02 mM H<,2>O<,2>分別增加了化療藥物的細(xì)胞毒性，其中0.02mMH<,2>O<,2>使ACHN細(xì)胞對(duì)阿霉素，長(zhǎng)春新堿的敏感性分別增加3.49倍，2.95倍(P<0.01)；786-0增加5.43倍，4.47倍((P<0.01)。而高濃度的H<,2>O<,2>(0.2mM)使阿霉素，長(zhǎng)春新堿對(duì)ACHN細(xì)胞的IC50值分別增加3.0及2.04倍，786-0細(xì)胞分別增加2.85，3.57倍((P

8、<0.01)。0.1mM、0.2mM H<,2>O<,2>顯著升高了ACHN，786-0的mdr1 mRNA表達(dá)水平，分別上調(diào)至對(duì)照組的1.29，3.4倍；1.35，2.82倍。相反，低濃度的(0.01 mM、0.02mM)H<,2>O<,2>降低了mdr1 mRNA表達(dá)水平，分別下1.18，4.05倍；1.22，3.76倍((P<0.01)。Western blot結(jié)果顯示P-gp的表達(dá)與mdr1mRNA轉(zhuǎn)錄水平呈現(xiàn)出一致性的變化。羅

9、丹明123實(shí)驗(yàn)顯示，0.02mMH<,2>O<,2>孵育AChN及786-0細(xì)胞72小時(shí)后不同程度使細(xì)胞內(nèi)Rh123蓄積增加，而0.2mMH<,2>O<,2>濃度下降低了Rh123的蓄積((P<0.01)。結(jié)論：1，外源性活性氧H<,2>O<,2>對(duì)腎癌ACHN及786-0細(xì)胞增殖具有雙重作用；低濃度H<,2>O<,2>能夠促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，高濃度抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。 2，我們首次意外發(fā)現(xiàn)，H<,2>O<,2>對(duì)腎癌ACHN及786-0細(xì)