Hv對(duì)SCA3-MJD細(xì)胞模型和轉(zhuǎn)基因果蠅模型的保護(hù)作用研究.pdf

1、背景：
　　 遺傳性脊髓小腦型共濟(jì)失調(diào)(hereditary spinocerebellar ataxia,SCAs)是一類常見的神經(jīng)系統(tǒng)遺傳病，根據(jù)neuromuscualr website(http://neuromuscular.wustl.edu/ataxia/domatax.html)截止到2009年11月5日發(fā)布的信息，迄今至少已定位了30種基因型，其中18個(gè)疾病基因已被克隆。脊髓小腦型共濟(jì)失調(diào)3型(spinocer

2、ebellar ataxia type3/Machado-Joseph disease,SCA3/MJD)為最常見的SCAs亞型，在中國(guó)人群中幾乎占常染色體顯性遺傳脊髓小腦型共濟(jì)失調(diào)的60％，其致病基因—MJD1基因編碼區(qū)的3’端含有一段CAG三核苷酸重復(fù)序列，正常人重復(fù)次數(shù)約12-40次，而SCA3/MJD患者可達(dá)52-86次，且CAG異常重復(fù)次數(shù)越多，發(fā)病年齡越早，癥狀越嚴(yán)重。
　　 迄今為止已發(fā)現(xiàn)九種神經(jīng)退行性疾病是由于致

3、病基因開放閱讀框(open reading frame,ORF)中CAG三核苷酸重復(fù)擴(kuò)展突變所致，包括SCA1、SCA2、SCA3/MJD、SCA6、SCA7、SCA17，以及亨廷頓舞蹈病(huntington disease,HD)、脊髓延髓肌萎縮癥(spinal andbulbar muscular atrophy,SBMA)、齒狀核紅核蒼白球路易體萎縮癥(dentatorubral-pallidoluysian atrophy,

4、DRPLA)。該類疾病統(tǒng)稱為多聚谷氨酰胺(polyglutamine,polyQ)疾病。目前有關(guān)polyQ疾病的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，臨床上亦缺乏有效的治療。
　　 組蛋白乙?；且环N翻譯后修飾，能導(dǎo)致染色質(zhì)結(jié)構(gòu)及轉(zhuǎn)錄調(diào)控的改變。目前認(rèn)為組蛋白乙?；c去乙?；皆诮M蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferase,HAT)和組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)的作用下保持著動(dòng)態(tài)

5、平衡，從而維持基因正常的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。有研究表明組蛋白乙酰化水平降低可能是引起細(xì)胞毒性作用、促發(fā)polyQ疾病轉(zhuǎn)錄異常的關(guān)鍵步驟。國(guó)內(nèi)外不少學(xué)者已經(jīng)在體外證實(shí)組蛋白去乙?；敢种苿?histone deacetylase inhibitors,HDACIs)能夠抑制polyQ蛋白的毒性作用，緩解HD、SBMA、DRPLA等的病情，延緩疾病進(jìn)展。然而對(duì)于同樣屬于polyQ病的SCA3/MJD疾病，至今國(guó)內(nèi)外尚未見有關(guān)運(yùn)用HDACIs進(jìn)行治

6、療的相關(guān)研究報(bào)道。
　　 Hv（因涉及到保密性問題，本實(shí)驗(yàn)研究中所運(yùn)用的組蛋白去乙?；敢种苿┙y(tǒng)一用“Hv”表示）屬于HDACIs中的短鏈脂肪酸類，其半衰期長(zhǎng)，毒副作用小，已在臨床上用于治療其他疾病多年。Hv除了通過抑制組蛋白去乙?；{(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄外，還可通過多條途徑，如通過誘導(dǎo)熱休克蛋白(heat shock protein,HSP)的表達(dá)來保護(hù)神經(jīng)元等。而在前期工作中，本課題組成員已證實(shí)HSP22對(duì)SCA3/MJD轉(zhuǎn)基因果蠅

7、模型具有保護(hù)作用，因此我們選用HDACIs中的Hv來進(jìn)行SCA3/MJD的治療研究。
　　 目的：
　　 探討Hv對(duì)SCA3/MJD細(xì)胞模型及轉(zhuǎn)基因果蠅模型的保護(hù)作用及其機(jī)制，為臨床上運(yùn)用HDACIs治療SCA3/MJD疾病提供科學(xué)的理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.應(yīng)用熒光顯微鏡技術(shù)了解Hv對(duì)SCA3/MJD細(xì)胞模型中異常蛋白聚集體的影響。
　　 2.運(yùn)用Western-blot技術(shù)檢測(cè)Hv對(duì)

8、野生型、含polyQ擴(kuò)展突變型ataxin-3蛋白及乙?；M蛋白H3和H4表達(dá)水平的影響。
　　 3.應(yīng)用PI/Annexin-V-FITC雙染流式細(xì)胞儀技術(shù)分析Hv對(duì)SCA3/MJD細(xì)胞模型凋亡率的影響。
　　 4.利用GAL4/UAS系統(tǒng)構(gòu)建在眼睛及神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)致病蛋白的SCA3/MJD轉(zhuǎn)基因果蠅模型。
　　 5.利用光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡觀察Hv對(duì)SCA3/MJD轉(zhuǎn)基因果蠅模型復(fù)眼的影響。
　　 6.

9、通過表型觀察，了解Hv對(duì)SCA3/MJD轉(zhuǎn)基因果蠅模型爬行能力及壽命的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.野生型ataxin-3蛋白在細(xì)胞中呈彌散分布，而polyQ擴(kuò)展突變型ataxin-3蛋白能在細(xì)胞中形成異常蛋白聚集體；不同劑量Hv干預(yù)后，polyQ擴(kuò)展突變型SCA3/MJD細(xì)胞模型中異常蛋白聚集體陽性細(xì)胞率及polyQ擴(kuò)展突變型ataxin-3蛋白的表達(dá)水平較其未給Hv干預(yù)對(duì)照組相比無明顯變化。
　　 2.PI

10、/Annexin V-FITC雙染流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示：未予以Hv干預(yù)的空載體pEGFP-N1轉(zhuǎn)染組及野生型pEGFP-N1-ataxin-3-20Q轉(zhuǎn)染組細(xì)胞早期凋亡率無明顯差異，而pEGFP-N1-ataxin-3-68Q轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的早期凋亡率明顯高于空載體組及野生型組細(xì)胞；不同劑量的Hv干預(yù)polyQ擴(kuò)展突變型SCA3/MJD細(xì)胞模型后，其早期細(xì)胞凋亡率明顯下降，且劑量越大凋亡率下降越明顯。
　　 3.Western-blo

11、t檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：未予以Hv干預(yù)的空載體pEGFP-N1轉(zhuǎn)染組及野生型pEGFP-N1-ataxin-3-20Q轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中乙?；M蛋白H3、H4表達(dá)水平無明顯差別，而polyQ擴(kuò)展突變型SCA3/MJD細(xì)胞模型中乙酰化組蛋白H3、H4表達(dá)水平低于空載體組和野生型組。不同劑量Hv干預(yù)后，隨著Hv劑量的增加，polyQ擴(kuò)展突變型SCA3/MJD細(xì)胞模型的乙?；M蛋白H3、H4表達(dá)水平逐漸升高。
　　 4.利用GAL4/UAS系統(tǒng)分別構(gòu)建

12、了在果蠅眼睛和神經(jīng)系統(tǒng)中以不同水平表達(dá)MJDtr-Q78蛋白的SCA3/MJD轉(zhuǎn)基因果蠅模型。該模型表現(xiàn)為進(jìn)行性的復(fù)眼結(jié)果破壞、色素脫失，爬行能力下降及壽命縮短，且其嚴(yán)重程度與MJDtr-Q78蛋白的表達(dá)量及表達(dá)部位有關(guān)。
　　 5.Hv干預(yù)SCA3/MJD轉(zhuǎn)基因果蠅模型后，其復(fù)眼結(jié)構(gòu)破壞及色素脫失好轉(zhuǎn)，且Hv劑量越大，復(fù)眼改善越明顯。
　　 6.Hv干預(yù)SCA3/MJD轉(zhuǎn)基因果蠅模型后，其爬行能力得到一定程度的改善，且

13、Hv劑量為1.0mM到1.5mM時(shí)爬行能力改善最明顯。
　　 7.一定劑量的Hv(0.5mM)能延長(zhǎng)SCA3/MJD轉(zhuǎn)基因果蠅模型的壽命，而當(dāng)Hv劑量過大時(shí)反而會(huì)縮短SCA3/MJD轉(zhuǎn)基因果蠅模型及野生型果蠅的壽命。
　　 結(jié)論：
　　 1.進(jìn)一步證實(shí)polyQ擴(kuò)展突變能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)異常蛋白聚集體的形成，發(fā)現(xiàn)Hv不能減少SCA3/MJD細(xì)胞模型中異常蛋白聚集體的形成和ataxin-3蛋白的表達(dá)。
　　 2.

14、進(jìn)一步證實(shí)polyQ擴(kuò)展突變能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，發(fā)現(xiàn)Hv可抑制polyQ擴(kuò)展突變型ataxin-3蛋白的細(xì)胞毒性作用，從而降低SCA3/MJD細(xì)胞的早期凋亡率。
　　 3.發(fā)現(xiàn)SCA3/MJD細(xì)胞模型中存在組蛋白H3、H4乙?；降慕档?，而Hv可提高SCA3/MJD細(xì)胞模型的組蛋白H3、H4乙?；?。
　　 4.成功地構(gòu)建了在果蠅眼睛和神經(jīng)系統(tǒng)中以不同水平表達(dá)MJDtr-Q78蛋白的SCA3/MJD轉(zhuǎn)基因果蠅模型，進(jìn)一步