大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性及BMP2在誘導(dǎo)其向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化中的作用.pdf

1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有高度的增殖和自我更新能力,并可分化為多種不同類型組織細(xì)胞.多年來,人們對骨髓的研究主要集中在造血干細(xì)胞上,并取得了可喜的成果.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞一度被認(rèn)為主要對造血干細(xì)胞的生長、增殖和分化起營養(yǎng)和支持作用,所以又稱之為骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bone marrow stromal cells).而近年來,隨著研究的深入,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的作用逐漸被拓展,人們發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)

2、干細(xì)胞具有多向分化潛能,能夠在一定條件下分化為包括神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞在內(nèi)的多種成體細(xì)胞.骨髓中這種非造血干細(xì)胞是中胚層來源的未分化細(xì)胞,目前已成功建立了一套較完整的體外培養(yǎng)擴增體系,并證實經(jīng)有關(guān)化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo),MSCs在體外可以分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞類型.應(yīng)用自體或異體細(xì)胞來取代、修復(fù)或加強受損組織、器官或系統(tǒng)生物學(xué)功能的治療方法稱之為細(xì)胞治療.隨著對骨髓MSCs研究的深入,

3、MSCs在細(xì)胞治療上所具有的潛在應(yīng)用價值逐漸被人們認(rèn)識.通過自體或異體移植MSCs進(jìn)行細(xì)胞治療,許多目前難以治療的疾病如帕金森氏病和阿爾海默茨病等困擾老年人的疾病將可能被攻克.在神經(jīng)系統(tǒng)外傷、手術(shù)后遺癥、缺血性或出血性等疾病中也同樣具有很大的潛力.但在體的MSCs遷徙分化不容易被控制,所以體外誘導(dǎo)MSCs分化的研究將為臨床移植提供必要的理論依據(jù)和治療基礎(chǔ).在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中,系統(tǒng)功能受到損害,現(xiàn)行的藥物治療、介入治療和基因治療對部分病人并

4、不能取得滿意的療效.研究發(fā)現(xiàn)MSCs在體內(nèi)及體外試驗中,均可以向神經(jīng)元樣細(xì)胞或膠質(zhì)樣細(xì)胞分化.這為臨床治療帶來新的希望.目前已應(yīng)用于臨床的胚胎干細(xì)胞移植存在取材、倫理、法律及免疫排斥等多種問題,這些缺陷限制了它在臨床上的應(yīng)用.而對于MSCs來說,則不存在上述困擾,其優(yōu)點顯而易見.首先MSCs來源廣泛,間葉組織來源的很多組織器官已經(jīng)發(fā)現(xiàn)MSCs的存在;其次取材方便,通?？扇∽宰泽w骨髓,簡單的骨髓穿刺就可獲得;另外由于細(xì)胞取自自體,應(yīng)用其誘

5、導(dǎo)分化而來的組織細(xì)胞進(jìn)行移植不存在組織配型及免疫排斥的問題;分化較容易,雖然體外誘導(dǎo)條件較難控制,但其環(huán)境依賴性很強,容易接受各種誘導(dǎo)因素的影響;而且易于外源基因的轉(zhuǎn)染和表達(dá),外源基因修飾的MSCs仍具有干細(xì)胞的高度增殖和自我更新特性,在體外可被大量擴增,可獲得足夠的工程細(xì)胞用于治療.相對于胚胎干細(xì)胞的取材也不存在倫理和法律的問題.所以MSCs作為細(xì)胞治療的移植來源,將為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的醫(yī)治開辟一條更理想的途徑.該課題在建立大鼠骨髓MSC

6、s體外分離、培養(yǎng)、純化及擴增體系的基礎(chǔ)上,研究MSCs在體外培養(yǎng)中的生物學(xué)特性,以及向神經(jīng)細(xì)胞分化的能力,為進(jìn)一步臨床治療提供理論依據(jù)及治療基礎(chǔ).實驗證實成體骨髓中存在具有多向分化潛力的成體干細(xì)胞,在體外增殖迅速,能夠在BMP2、BME、BDNF、Bfgf、EGF等因子的作用下,分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞,這為今后的臨床移植治療提供了潛在的細(xì)胞源泉.實驗采用密度為1.073g/cm3的Percoll分離液,通過密度梯度離心法分離得到大鼠骨髓單個

7、核細(xì)胞,利用MSCs貼壁速率快的特點,接種早期更換培養(yǎng)基去掉非貼壁細(xì)胞.經(jīng)原代及傳代培養(yǎng)擴增MSCs后,研究其在體外培養(yǎng)中的生長曲線、貼壁率、分裂指數(shù)、細(xì)胞周期等生物學(xué)特性及其超微結(jié)構(gòu),并在脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)體系的作用下誘導(dǎo)其向脂肪細(xì)胞分化,從而鑒定其分化潛能.在此基礎(chǔ)上,通過BMP2、BME、BDNF、Bfgf、EGF等幾種誘導(dǎo)因子的作用,誘導(dǎo)MSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞或膠質(zhì)樣細(xì)胞分化,觀察細(xì)胞形態(tài)變化,以免疫細(xì)胞化學(xué)檢測nestin、NSE、

8、GFAP的表達(dá)作為觀測指標(biāo).實驗結(jié)果如下:1.貼壁培養(yǎng)法結(jié)合密度梯度離心,獲得純度較高的MSCs;進(jìn)行了細(xì)胞生長曲線、貼壁率、分裂指數(shù)、周期等生物學(xué)特性和超微結(jié)構(gòu)的觀測,結(jié)果與間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性相吻合.2.該實驗分離的細(xì)胞群在體外可以被誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞,大部分細(xì)胞為SH3免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽性,透視電鏡觀察顯示培養(yǎng)細(xì)胞屬于較幼稚待分化的細(xì)胞類型.3.使用BMP2、BME、BDNF、Bfgf、EGF等因子誘導(dǎo)MSCs后可見到神經(jīng)元樣

9、或膠質(zhì)樣細(xì)胞出現(xiàn),nestin、NSE、GFAP免疫組化證實了大量神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞表面抗原的表達(dá),且與對照組差異顯著.4.BMP2單獨誘導(dǎo)可以使MSCs部分分化為神經(jīng)元樣或膠質(zhì)樣細(xì)胞,采用BMP2、BDNF、Bfgf和EGF協(xié)同誘導(dǎo)后出現(xiàn)較多神經(jīng)元樣或膠質(zhì)樣細(xì)胞,且nestin、NSE、GFAP陽性細(xì)胞顯著增多,細(xì)胞生長狀況較佳.5.BME誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞能較早地分化為神經(jīng)元樣或膠質(zhì)樣細(xì)胞,誘導(dǎo)后nestin、NSE、GFAP陽性細(xì)胞較多(

10、與BMP2、BDNF、Bfgf和EGF聯(lián)合誘導(dǎo)組無顯著差異),但細(xì)胞生長狀況較差,在早期即有大量細(xì)胞細(xì)胞死亡.結(jié)論:1.該實驗分離培養(yǎng)的細(xì)胞群與間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性吻合,具有向脂肪細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞分化的潛能,SH3免疫細(xì)胞化學(xué)染色證實為非造血細(xì)胞,電鏡結(jié)果顯示為較幼稚細(xì)胞,表明此細(xì)胞群為間充質(zhì)干細(xì)胞;2.BMP2等多種誘導(dǎo)因素能夠誘導(dǎo)MSCs向神經(jīng)元樣或膠質(zhì)樣細(xì)胞分化,協(xié)同采用BMP2、BDNF、Bfgf和EGF的誘導(dǎo)結(jié)果最佳,且細(xì)胞