新型細(xì)胞聚集體的構(gòu)建及其應(yīng)用于軟骨組織再生的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、由創(chuàng)傷、先天性畸形和手術(shù)切除病變等原因造成的軟骨缺損給患者的生存質(zhì)量帶來(lái)很大的影響。常用的修復(fù)方法如自體、異體軟骨移植、人工替代物修復(fù)等，都有一定的局限性。所以，軟骨缺損的修復(fù)和治療一直是困擾臨床醫(yī)生的一個(gè)難題。而軟骨組織工程技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展，為解決這些問(wèn)題提供了可能。 傳統(tǒng)概念中，軟骨組織工程技術(shù)研究領(lǐng)域主要包括種子細(xì)胞、支架材料、生長(zhǎng)因子三方面內(nèi)容。經(jīng)過(guò)近20 年的研究，軟骨組織工程研究已經(jīng)取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展。人們逐漸認(rèn)識(shí)到模

2、擬組織發(fā)育進(jìn)行組織構(gòu)建的重要性，以及應(yīng)該盡量避免使用異體、異種材料，并已經(jīng)在進(jìn)行積極的研究和探索。 本課題提出了新的軟骨細(xì)胞構(gòu)建方法---軟骨細(xì)胞聚集體(ChondrocyteMacroaggregate)技術(shù)，其主要策略是利用分離的原代細(xì)胞和擴(kuò)增后的軟骨細(xì)胞按照特定的培養(yǎng)程序在體外構(gòu)建出的細(xì)胞-自分泌基質(zhì)復(fù)合體，擴(kuò)增的軟骨細(xì)胞在原代細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)表面上粘附并實(shí)現(xiàn)三維立體生長(zhǎng)，它的優(yōu)勢(shì)在于：1.保持了擴(kuò)增細(xì)胞良好的功能表

3、型，在細(xì)胞數(shù)量增加的同時(shí)兼顧了細(xì)胞的分化能力；2.良好的生物相容性和低免疫源性；3.高的細(xì)胞利用效率；4.通過(guò)與天然基質(zhì)材料結(jié)合，可以進(jìn)行特定形態(tài)的組織構(gòu)建。 實(shí)驗(yàn)對(duì)構(gòu)建軟骨細(xì)胞聚集體的理化性質(zhì)、組織學(xué)結(jié)構(gòu)和生化成分進(jìn)行了分析；通過(guò)體外三維構(gòu)建和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評(píng)估了軟骨細(xì)胞聚集體體外軟骨形成能力和體內(nèi)形成特定形態(tài)軟骨的能力。進(jìn)一步，提出內(nèi)支撐體結(jié)合細(xì)胞聚集體的三維構(gòu)建策略，研究可吸收性內(nèi)支撐體的構(gòu)建方法，探索新的特定形態(tài)軟骨組織的構(gòu)建

4、思路。 實(shí)驗(yàn)一軟骨細(xì)胞聚集體的構(gòu)建以及組織形態(tài)學(xué)觀察 目的：通過(guò)兩步細(xì)胞沉淀法制備軟骨細(xì)胞聚集體, 并檢測(cè)制備效果和質(zhì)量。 方法：切取兔耳軟骨組織，通過(guò)酶消化法制備原代軟骨細(xì)胞，將原代細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并分為三等分，取1/3 平均接種至3 個(gè)六厘米直徑培養(yǎng)皿中，構(gòu)建單層軟骨細(xì)胞膜片。其他細(xì)胞接種至75 cm2 培養(yǎng)瓶中，擴(kuò)增培養(yǎng)十天，待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底，消化，搜集細(xì)胞。將獲取細(xì)胞高密度接種至生長(zhǎng)有軟骨細(xì)胞膜片的培養(yǎng)皿

5、上。孵育十四天后，觀察軟骨細(xì)胞聚集體的形成情況和理化性能，并進(jìn)行組織學(xué)染色和電鏡觀察。 結(jié)果：經(jīng)過(guò)體外孵育，軟骨細(xì)胞聚集體為半透明膜狀物，質(zhì)有彈性，可用金屬鑷鉗夾操作。HE染色證實(shí)有幼稚的軟骨基質(zhì)形成，并形成類似軟骨陷窩樣的組織結(jié)構(gòu)。番紅-O染色證實(shí)有糖胺聚糖成分在基質(zhì)中合成。 結(jié)論：將原代軟骨細(xì)胞和傳代的軟骨細(xì)胞做共培養(yǎng)，有利于傳代細(xì)胞的表型恢復(fù)，并可以形成結(jié)構(gòu)均勻的軟骨細(xì)胞聚集體。形成的聚集體含有大量細(xì)胞外基質(zhì)，且

6、具有一定的機(jī)械強(qiáng)度，可以用于組織工程軟骨的構(gòu)建。 實(shí)驗(yàn)二軟骨細(xì)胞聚集體體外構(gòu)建軟骨組織 目的：在外支架構(gòu)建策略下，觀察軟骨細(xì)胞聚集體體外發(fā)育成軟骨組織的能力。 方法：靜態(tài)培養(yǎng)條件下，將軟骨細(xì)胞聚集體移入圓柱形金屬網(wǎng)外支架中，進(jìn)行體外孵育4 周后，觀察聚集體之間的融合情況，并通過(guò)組織學(xué)染色觀察組織成熟情況。 結(jié)果：大體觀察，體外孵育四周后，在構(gòu)建體外周部分的軟骨細(xì)胞聚集體發(fā)生了組織融合，并形成了比較成熟的軟

7、骨組織，而在構(gòu)建體的中央部分，軟骨聚集體之間的分層非常明顯，沒(méi)有形成成熟的軟骨組織。 結(jié)論：在營(yíng)養(yǎng)交換良好的環(huán)境下，軟骨細(xì)胞聚集體具備繼續(xù)成熟并發(fā)育為軟骨組織的能力，外支架策略為軟骨細(xì)胞聚集體的體外三維構(gòu)建提供了塑形的方法。 實(shí)驗(yàn)三軟骨細(xì)胞聚集體構(gòu)建氣管軟骨的實(shí)驗(yàn)研究 目的：利用外支撐技術(shù)結(jié)合軟骨細(xì)胞聚集體技術(shù)，在動(dòng)物體內(nèi)構(gòu)建出管狀軟骨，以檢測(cè)軟骨細(xì)胞聚集體體內(nèi)構(gòu)建特定形態(tài)軟骨的能力。 方法：按實(shí)驗(yàn)一所

8、述方法構(gòu)建出軟骨細(xì)胞聚集體后，以硅膠管為外支撐體，將其均勻纏繞在硅膠管外表面。體外短時(shí)間孵育，使軟骨細(xì)胞聚集體與硅膠管牢靠貼附后，將構(gòu)建的管狀移植體植入細(xì)胞供體動(dòng)物（新西蘭兔）背部皮下。體內(nèi)孵育8周后，取出標(biāo)本。從大體形態(tài)，組織學(xué)結(jié)構(gòu)、免疫組化以及GAG 含量、生物力學(xué)性能等方面評(píng)價(jià)形成軟骨的質(zhì)量。 結(jié)果：通過(guò)此策略構(gòu)建的管狀軟骨具有良好的生物相容性，未見免疫炎癥反應(yīng)產(chǎn)生。形成的軟骨保持著良好的管狀外形，組織學(xué)結(jié)構(gòu)類似于天然軟骨

9、，含有豐富的蛋白多糖和膠原纖維。 結(jié)論：軟骨細(xì)胞聚集體在體內(nèi)具有良好的軟骨形成能力。形成的組織結(jié)構(gòu)均勻，細(xì)胞表型維持良好，并為氣管軟骨的再造提供了新的方法。 實(shí)驗(yàn)四仿生細(xì)胞外基質(zhì)的構(gòu)建及其作為內(nèi)支撐體的可行性研究 目的：制備出具有軟骨形成能力、塑形性強(qiáng)且有一定機(jī)械性能的仿生細(xì)胞外基質(zhì)，為構(gòu)建可吸收性內(nèi)支撐體提供技術(shù)支持。 方法：選擇透明質(zhì)酸酯無(wú)紡網(wǎng)樣支架和膠原凝膠作為基質(zhì)材料。分離兔軟骨細(xì)胞，體外擴(kuò)增、

10、收獲后，以一定的細(xì)胞濃度與液態(tài)膠原共混，將其接種進(jìn)入透明質(zhì)酸酯無(wú)紡網(wǎng)樣支架中，待形成細(xì)胞凝膠共聚體后，繼續(xù)進(jìn)行體外孵育。觀察細(xì)胞孵育過(guò)程中細(xì)胞仿生細(xì)胞外基質(zhì)形態(tài)變化情況、內(nèi)部細(xì)胞增殖和形態(tài)變化情況。 結(jié)果：通過(guò)上述策略，可以形成形態(tài)穩(wěn)定的細(xì)胞基質(zhì)共混體，細(xì)胞在內(nèi)部具有良好的表型和均勻的分布。形成的細(xì)胞基質(zhì)共混體可有個(gè)體性的形態(tài)，有一定的機(jī)械性能，可成為可吸收性內(nèi)支撐體。 結(jié)論：透明質(zhì)酸酯-膠原凝膠可以構(gòu)建出軟骨細(xì)胞移植體

11、，并為細(xì)胞聚集體提供形態(tài)支撐的技術(shù)平臺(tái)。 實(shí)驗(yàn)五軟骨細(xì)胞聚集體構(gòu)建人鼻翼軟骨的研究 目的：運(yùn)用仿生細(xì)胞外基質(zhì)-軟骨細(xì)胞聚集體構(gòu)建策略，在有免疫動(dòng)物體內(nèi)構(gòu)建鼻翼外形軟骨。 方法：以新西蘭兔為動(dòng)物模型，取自體軟骨細(xì)胞，體外擴(kuò)增、收獲后，分別構(gòu)建鼻翼外形的仿生細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)支撐體和軟骨細(xì)胞聚集體。然后，將軟骨細(xì)胞聚集體小心纏繞在內(nèi)支撐體外周。與此對(duì)照，構(gòu)建鼻翼外形金屬網(wǎng)外支架，將細(xì)胞聚集體離心于外支架中體外孵育。將兩種方

12、法獲得的鼻翼軟骨移植體分別植入動(dòng)物體內(nèi)，12 周后，取出標(biāo)本，進(jìn)行大體外形、組織學(xué)形態(tài)、生物化學(xué)以及生物力學(xué)性能分析，并比較兩種策略構(gòu)建出的軟骨質(zhì)量的差別，以篩選出合適的構(gòu)建策略。 結(jié)果：通過(guò)內(nèi)支撐體構(gòu)建的軟骨移植體具有穩(wěn)定的外形，能在動(dòng)物體內(nèi)形成外形理想的鼻翼軟骨，組織學(xué)結(jié)構(gòu)、生物化學(xué)以及生物力學(xué)指標(biāo)均顯示構(gòu)建的軟骨具有良好的質(zhì)量，可以滿足生理學(xué)需要。 結(jié)論：仿生細(xì)胞外基質(zhì)-軟骨細(xì)胞聚集體是構(gòu)建特定形態(tài)軟骨的新策略。良