CpG ODN抑制EB病毒復(fù)制的體外研究.pdf

1、目的：EB病毒（EBV）是一種人類皰疹病毒，其感染非常普遍，是兒童較常見(jiàn)的傳染性單核細(xì)胞增多癥的病因，也與很多其它疾病相關(guān)，迄今尚無(wú)安全、有效的疫苗和治療藥物。人工合成富含非甲基化胞嘧啶（C）-鳥(niǎo)嘌呤（G）二核苷酸基序的CpG寡脫氧核苷酸（CpG ODN）作為Th1型免疫調(diào)節(jié)劑已用于抗多種病毒和細(xì)菌感染的研究，但尚未見(jiàn)抗EB病毒感染的報(bào)道，本研究初步探討了CpG ODN在體外對(duì)該病毒的抑制作用及其可能機(jī)制。 方法： 1、

2、總結(jié)重癥傳染性單核細(xì)胞增多癥（IM）患兒臨床資料；分析重癥IM患兒EBV-DNA拷貝數(shù)與血液系統(tǒng)、肝功能和心肌受損程度及其預(yù)后的關(guān)系。 2、觀察CpG ODN抑制EBV復(fù)制的量效關(guān)系：分離健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），設(shè)立空白對(duì)照組，EBV對(duì)照組，CpG ODN預(yù)處理組，用2.5mg/L，5mg/L，10mg/L，20mg/L，的CpG ODN預(yù)處理48h，感染EBV，24h后用熒光定量PCR（FQ-PCR）檢測(cè)EBV拷貝

3、數(shù)； 3、觀察CpG ODN抑制EBV復(fù)制的時(shí)效關(guān)系：設(shè)組同上，用10mg/L的CpG ODN分別預(yù)處理PBMC6h，12h，24h，48h，感染EBV，24h后用FQ-PCR檢測(cè)EBV拷貝數(shù)； 4、觀察CpG誘導(dǎo)γ干擾素（IFN-γ）產(chǎn)生的量效時(shí)效關(guān)系：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)上述實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)上清液中γ干擾素（IFN-γ）的水平； 5、中和CpG誘導(dǎo)IFN-γ：設(shè)組同2，用2.5mg/L，5mg/L，1

4、0mg/L，20mg/L的CpG ODN預(yù)處理48h后，加入抗IFN-γ單抗（5mg/L），再感染EBV，24h后用FQ-PCR檢測(cè)EBV拷貝數(shù)； 6、TLR9和CD21mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)：設(shè)立空白對(duì)照組，EBV對(duì)照組，CpG ODN對(duì)照組，CpG ODN預(yù)處理組，采用逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法檢測(cè)各組PBMC中TLR9和CD21mRNA的表達(dá)水平。 結(jié)果： 1、本組重癥傳染性單核細(xì)胞增多癥患兒共

5、22例，男12例，女10例；男女比例為1.2：1，本組患兒均有多臟器受累，隨著EBV-DNA拷貝數(shù)的升高，重癥傳染性單核細(xì)胞增多癥患兒的紅細(xì)胞、血紅蛋白、血小板均呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)（P〈0.05）；患兒肝功能ALT、AST、LDH呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)（P〈0.05）；患兒心肌酶譜HBDH、AST、LDH呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)（P〈0.05）； 2、不同濃度CpG ODN預(yù)處理組的EBV拷貝數(shù)均低于未處理組（P<0.05），其中10mg/L CpG

6、 ODN預(yù)處理組EBV拷貝數(shù)最低，為（3.85±0.37）×108拷貝/L； 3、CpG ODN預(yù)處理48h組的EBV拷貝數(shù)（11.32±0.83）×108拷貝/L，低于其余各預(yù)處理時(shí)間組的EBV拷貝數(shù)（P<0.05）； 4、不同濃度CpG ODN預(yù)處理組培養(yǎng)上清液IFN-γ濃度均高于EBV對(duì)照組和空白對(duì)照組（P<0.05），其中10mg/L CpG ODN處理組IFN-γ濃度最高（66.27±6.29）ng/L；

7、 5、CpG ODN預(yù)處理48 h組培養(yǎng)上清液IFN-γ（51.74±4.09）ng/L高于其余各預(yù)處理時(shí)間組、EBV對(duì)照組及空白對(duì)照組（P〈0.05）； 6、使用IFN-γ單抗中和CpG ODN預(yù)處理誘導(dǎo)的IFN-γ后，各濃度CpG ODN預(yù)處理組EBV拷貝數(shù)與EBV對(duì)照組相比無(wú)明顯差異，且各濃度CpG ODN預(yù)處理組之間EBV拷貝數(shù)也無(wú)明顯差異（P>0.05）： 7、CpG ODN預(yù)處理組TLR9mRNA水平明顯高

8、于未處理組（P<0.05）；各組CD21mRNA水平無(wú)明顯差異（P>0.05）。 結(jié)論： 1、IM主要是由EBV感染引起的急性或亞急性免疫異常性疾病，是兒童常見(jiàn)的病毒性傳染病。重癥IM病情的輕重、多器官受損程度和預(yù)后與EBV拷貝數(shù)有關(guān)。重癥IM除了一般IM所具有的癥狀、體征、實(shí)驗(yàn)室檢查特點(diǎn)外，還可累及多臟器，產(chǎn)生各種并發(fā)癥，因此恢復(fù)緩慢，可達(dá)數(shù)月之久，病程遷延甚至死亡； 2、CpG ODN在體外對(duì)EBV的復(fù)制具有

9、抑制作用，且這種抑制作用是有劑量依賴性的，在CpG ODN的濃度為10mg/L時(shí)抑制效果最好，提示CpG ODN只有在適當(dāng)劑量才能發(fā)揮抑制病原體的作用； 3、CpG ODN預(yù)處理48 h抗EBV效果最好，隨著CpG ODN預(yù)處理時(shí)間的延長(zhǎng)，EBV拷貝數(shù)呈逐漸降低的趨勢(shì)，表明CpG ODN抗EBV的作用有時(shí)間依賴性； 4、CpG ODN可上調(diào)PBMC中TLR9的表達(dá)，但對(duì)PBMC上EBV的受體CD21的表達(dá)無(wú)明顯作用，提示

10、CpG ODN對(duì)EBV的抑制是通過(guò)活化TLR9繼而誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生而間接起作用的，而不是通過(guò)直接阻斷EBV在PBMC上的受體CD21起作用的。 5、CpG ODN誘導(dǎo)細(xì)胞因子IFN-γ同樣具有劑量依賴性和時(shí)間依賴性，其中10mg/L CpG ODN組和CpG ODN預(yù)處理48h組LFN-γ量最高，并且使用抗IFN-γ單抗中和CpG ODN預(yù)處理誘導(dǎo)的IFN-γ后，對(duì)EBV的抑制作用明顯下降，提示CpG ODN對(duì)EBV的抑制很大