CpG ODN防治結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究目的 觀察肺結(jié)核病人外周血單個(gè)核細(xì)胞Th1/Th2型免疫反應(yīng)變化以及CpG ODN對(duì)Th1/Th2型免疫反應(yīng)的影響.研究CpG ODN對(duì)結(jié)核病小鼠Th1/Th2型免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用,明確CpG ODN對(duì)結(jié)核病的預(yù)防和免疫治療作用.研究方法第一部分選取20例初發(fā)活動(dòng)性肺結(jié)核病人和20例健康人為研究對(duì)象.留取血標(biāo)本并分離外周血單個(gè)細(xì)胞(PBMC).分別用RPMI 1640和RPMI 1640+PPD(10μg/ml)培養(yǎng)48小時(shí)后,用R

2、T-PCR測(cè)定PBMC的FN-γ mRNA和IL-10mRNA表達(dá).同時(shí)對(duì)PBMC進(jìn)行CD3/CD8表面抗原染色和胞內(nèi)抗IFN-γ和IL-4染色,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)T細(xì)胞亞群比例.第二部分 20例初發(fā)活動(dòng)性肺結(jié)核病人和20例健康人PBMC各分為4份,分別用RPMI 1640,PPD,CpG ODN,CpG ODN+PPD培養(yǎng)48小時(shí).用real-timePCR檢測(cè)PBMC的IFN-γmRNA、IL-10mRNA和IL-12mRNA表達(dá).第

3、三部分 96只雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分成4組(n=24),分別為CpG ODN預(yù)防組(A),對(duì)照ODN預(yù)防組(B),感染對(duì)照組(C)和健康對(duì)照組(D).A組和B組小鼠于攻毒前2周分別腹腔注射CpG ODN和對(duì)照ODN(30μg/只).隨后A組,B組和C組小鼠尾靜脈內(nèi)注射結(jié)核菌(1×10<'6>/只).于感染后3周每組分別處死小鼠12只,稱取小鼠體重和肺脾濕重.肺和脾置10﹪中性甲醛固定,制作病理切片和抗酸染色.肺組織和脾組織進(jìn)行結(jié)核菌

4、培養(yǎng)和菌落計(jì)數(shù).用RT-PCR測(cè)定小鼠肺脾組織TLR9(toll-like receptor 9)mRNA表達(dá).real time-PCR 檢測(cè)小鼠肺脾組織IFN-γmRNA、IL-10m,IL-4mRNA和IL-6mRNA的表達(dá).每組剩余12只小鼠,觀察60天生存率.第四部分 72只雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分成3組(n-24),分別為CpG ODN治療組(A),感染對(duì)照組(C)和健康對(duì)照組(C).A組和B組小鼠尾靜脈內(nèi)注射結(jié)核菌(1×

5、10<'6>/只)制作結(jié)核病小鼠模型.A組小鼠于攻毒后1周單次腹腔注射CpG ODN(30μg/只),B組小鼠腹腔注射生理鹽水.于CpG ODN治療后3周每組分別處死小鼠12只,稱取小鼠體重和肺脾濕重.肺和脾置10﹪中性甲醛固定,制作病理切片和抗酸染色.肺組織和脾組織進(jìn)行結(jié)核菌培養(yǎng)和菌落計(jì)數(shù).real time-PCR檢測(cè)小鼠肺脾組織IFN-γmRNA,IL-12p40mRNA,IL-10mRNA,IL-4mRNA和IL-6mRNA的表