人皮膚干細(xì)胞誘導(dǎo)分化構(gòu)建人工結(jié)膜的實驗研究.pdf

1、眼表包括健康的眼表上皮細(xì)胞和完整的淚膜。其中，眼表上皮細(xì)胞又包括角膜上皮細(xì)胞和結(jié)膜上皮細(xì)胞，二者的健康狀態(tài)不僅可保障正常的眼表功能，還有維持完整淚膜的重要作用。通常，在外露的角膜上皮和結(jié)膜上皮表面被覆著薄層的淚膜。淚膜不僅構(gòu)成眼球與外界環(huán)境的交界面而且還形成保護(hù)角膜和結(jié)膜的屏障。淚膜中適量的電解質(zhì)、蛋白、黏液和磷脂等成分不僅可維持角膜的透明性，還可保證角膜上皮細(xì)胞和結(jié)膜上皮細(xì)胞的健康狀態(tài)。當(dāng)眼表遭到諸如：干燥、強光、嚴(yán)寒、機械性刺激、物

2、理性損傷、腐蝕性化學(xué)傷以及細(xì)菌性、病毒性和寄生蟲性的感染時，均可引起應(yīng)激性的淚膜變化。此外，淚膜不僅對外源性的各類刺激產(chǎn)生應(yīng)激性反應(yīng)，還有維持眼表上皮細(xì)胞內(nèi)源性需要的作用，而眼表上皮細(xì)胞的健康狀態(tài)也可直接影響到淚膜的狀態(tài)。所以淚膜的成分、結(jié)構(gòu)和分泌量都受到多因素的影響。此外，淚膜所構(gòu)成的穩(wěn)定液體膜不但可保護(hù)、維持健康的角膜和結(jié)膜上皮細(xì)胞，而且還可確保透明角膜提供清晰的視光學(xué)區(qū)。 在人類眼表由于結(jié)膜的表面積為角膜表面積的17倍，當(dāng)

3、其受到物理或化學(xué)損傷時，不但嚴(yán)重破壞眼表上皮的完整性和分泌功能，還可造成結(jié)膜的粘連和瘢痕形成，從而造成眼表的嚴(yán)重?fù)p壞。目前，雖然有自體結(jié)膜移植、唇粘膜移植、異體羊膜移植等治療方法的報告，但是自體結(jié)膜來源受限，唇粘膜和異體羊膜缺乏結(jié)膜組織的功能，效果欠佳。因此需要我們開發(fā)出一種在組織學(xué)形態(tài)及生物功能上都接近結(jié)膜組織的生物材料作為治療眼表損傷的結(jié)膜移植替代物。 干細(xì)胞是一類存在于皮膚、骨髓、肝臟及中樞神經(jīng)系統(tǒng)等許多組織中、并具有高度

4、增殖潛能和無限自我更新能力的細(xì)胞亞群，能自我更新并長期維持組織結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，體外培養(yǎng)條件下或創(chuàng)傷時被激活，并開始增殖、再生以重建組織，具有高度的增殖潛能。與其他組織的干細(xì)胞相似，表皮的角質(zhì)形成細(xì)胞干細(xì)胞(keratinocytestemcells，KSC)不僅對于皮膚組織的自身穩(wěn)定和創(chuàng)傷愈合具有重要作用，而且具有上皮性始祖細(xì)胞的功能。目前對KSC的研究已取得較大進(jìn)展，表皮是一種分層、快速更新的組織，角質(zhì)形成細(xì)胞(KC)的再生是由基底層內(nèi)

5、干細(xì)胞和短暫擴(kuò)增細(xì)胞(transitamplifyingcells，TAC)兩種增生細(xì)胞的特殊體系來完成的。此外，有學(xué)者報道：在外胚層器官發(fā)育過程中，皮膚的上皮細(xì)胞與眼表上皮細(xì)胞(結(jié)膜、角膜、淚腺等)均來源于同一胚層，具有高度的同源性。 基于上述，本研究進(jìn)行了以下方面的工作：人皮膚干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化構(gòu)建人工結(jié)膜的實驗研究 目的：觀察皮膚干細(xì)胞在結(jié)膜去細(xì)胞基質(zhì)膜上的生長和分化情況，探討利用皮膚干細(xì)胞及結(jié)膜去細(xì)胞基質(zhì)膜構(gòu)建人

6、工結(jié)膜的可能性。 方法：將體外分離培養(yǎng)的1～2代人皮膚干細(xì)胞接種于人結(jié)膜去細(xì)胞基質(zhì)膜上，在體外觀察細(xì)胞的分化情況。標(biāo)本分別行HE染色、人上皮細(xì)胞角蛋白K19單克隆抗體、結(jié)膜上皮細(xì)胞特異性標(biāo)記蛋白K8抗體、K13抗體、MUC5A/C抗體免疫組化鑒定。 結(jié)果：皮膚干細(xì)胞在結(jié)膜去細(xì)胞基質(zhì)膜等模擬的體外微環(huán)境下可形成類似結(jié)膜上皮細(xì)胞的復(fù)層增生，并有類結(jié)膜上皮細(xì)胞特異性標(biāo)記蛋白表達(dá)，呈K8抗體、K13抗體、MUC5A/C抗體表達(dá)陽

7、性。 結(jié)論：利用皮膚干細(xì)胞可在體外模擬的微環(huán)境下分化構(gòu)建人工結(jié)膜，用于結(jié)膜移植眼表重建。 人工結(jié)膜組織生物學(xué)特性檢測的實驗研究 目的：檢測經(jīng)誘導(dǎo)分化后的類結(jié)膜上皮細(xì)胞中β-2-microglobulin、keratin13基因的表達(dá)及人工結(jié)膜組織中特異性蛋白(CK13、MUC5AC)的表達(dá)情況。 方法：試驗組細(xì)胞以結(jié)膜上皮細(xì)胞為飼養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，并設(shè)立空白對照組細(xì)胞培養(yǎng)相同時間，分別于第1、3、5、7日

8、取各組細(xì)胞提取RNA進(jìn)行實時RT-PCR定量檢測各組β-2-microglobulin、keratin13基因的表達(dá)情況；并用免疫印記的方法檢測體外構(gòu)建人工結(jié)膜組織膜中是否有結(jié)膜特異性CK13及MUC5AC蛋白的表達(dá)。 結(jié)果：試驗組細(xì)胞共培養(yǎng)3天后出現(xiàn)β-2-microglobulin、keratin13基因的表達(dá)，5、7天的表達(dá)量顯著提高；經(jīng)體外構(gòu)建10天、20天的人工結(jié)膜都有與正常結(jié)膜組織相同的CK13和MUC5AC蛋白的表

9、達(dá)。 結(jié)論：經(jīng)本實驗方法構(gòu)建的人工結(jié)膜組織膜具有與正常結(jié)膜組織相似的分子生物學(xué)特性。 人工結(jié)膜體內(nèi)移植的動物實驗研究 目的：將人工結(jié)膜組織移植于試驗動物眼表，觀察移植后的人工結(jié)膜在動物體內(nèi)的誘導(dǎo)、分化結(jié)果。 方法：新西蘭白兔20只，隨機分為4組，完全剪除右眼球結(jié)膜，并在上方鞏膜處植入人工結(jié)膜組織，分布于1、2、3、4周后取移植的人工結(jié)膜組織行冰凍切片，標(biāo)本分別行PAS染色、人結(jié)膜上皮細(xì)胞特異性標(biāo)記蛋白K1