兔股動(dòng)脈斑塊模型中組織因子及其途徑抑制物-2的表達(dá)及藥物干預(yù).pdf

1、背景： 組織因子(Tissue Factor，TF)通過促血栓形成、促血管平滑肌細(xì)胞遷移和增殖、誘導(dǎo)內(nèi)膜細(xì)胞新生等途徑參與動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)斑塊的形成。組織因子途徑抑制物-2(Tissue Factor Pathway Inhibitot-2，TFPI-2)與組織因子途徑抑制物-1(Tissue Factor Pathway Inhibitor-1，TFPI-1)同屬廣譜絲氨酸蛋白酶抑制劑家族，

2、是TF的生理性抑制劑，具維持細(xì)胞外基質(zhì)穩(wěn)定性的作用；初步的研究提示其具有抑制AS斑塊形成的作用。目前對(duì)AS形成過程中TF及TFPI-2的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律尚缺乏系統(tǒng)研究，對(duì)此問題的闡明有助于尋求有效的干預(yù)措施、對(duì)AS的防治具有重要理論意義。 目的： 1．觀察兔股動(dòng)脈粥樣硬化斑塊發(fā)展過程中斑塊組織內(nèi)TF及TFPI-2的變化規(guī)律，并同步觀察MMP-2的表達(dá)變化。 2．確立血漿及組織TFPI-2表達(dá)與動(dòng)脈斑塊形成之間的動(dòng)態(tài)聯(lián)

3、系。 3．探討丹參多酚酸鹽(Magnesium Lithospermate B，MLB)對(duì)斑塊內(nèi)TF及TFFP-2的影響，并同步觀察MMP-2的表達(dá)變化。 4．研究干預(yù)TFPI-2途徑后對(duì)斑塊形成的影響，從而反證TFPI-2在斑塊形成中的重要作用。 材料及方法： 1．建立動(dòng)脈粥樣硬化模型。新西蘭雄兔通過1％高膽固醇飼料飼養(yǎng)8周后，在X線透視下經(jīng)頸動(dòng)脈行股動(dòng)脈球囊損傷，并繼續(xù)高脂飼養(yǎng)，建立動(dòng)脈粥樣硬化模型。

4、通過造模前后的股動(dòng)脈造影血流幀數(shù)計(jì)數(shù)，測(cè)量管腔內(nèi)徑，來建立評(píng)價(jià)血流的方法。 2．第一部分研究：在建模8周、10周和12周，分別采血及處死動(dòng)物，通過時(shí)間分辨免疫熒光分析法測(cè)定血漿TFPI-2水平。分別截取球囊損傷處股動(dòng)脈標(biāo)本，采用定量病理切片圖像分析技術(shù)測(cè)量斑塊內(nèi)膜及中膜厚度、泡沫細(xì)胞陽性面積，計(jì)算內(nèi)膜/中膜比值及泡沫細(xì)胞陽性面積比；免疫組化一半定量圖像分析技術(shù)檢測(cè)斑塊組織內(nèi)TF、TFPI-2和MMP-2的蛋白表達(dá)；熒光定量PCR

5、測(cè)定斑塊內(nèi)TF和TFPI-2的mRNA水平。通過相關(guān)分析，計(jì)算血漿TFPI-2和組織TFPI-2的相關(guān)系數(shù)。 3．第二部分研究：將新西蘭雄兔隨機(jī)分為正常飼養(yǎng)組、球囊損傷對(duì)照組及治療組；后兩組建AS斑塊模型。治療組每天給予丹參多酚酸鹽50mg/kg靜脈注射共干預(yù)7天，球囊損傷對(duì)照組給予生理鹽水注射。測(cè)定血凝血酶原時(shí)間(Prothrombin Time，PT) 和活化部分凝血酶原時(shí)間(Actived PartialProth：rom

6、bin Time，APTT)值。采用與第一部分相同的研究方法、測(cè)量丹參多酚酸鹽治療后血漿及組織TFPI-2蛋白水平的變化，檢測(cè)斑塊織中TF，TFPI-2基因的表達(dá)以及TF，TFPI-2和MMP-2蛋白表達(dá)的水平。同時(shí)，測(cè)量血管的內(nèi)膜中膜比值和泡沫細(xì)胞陽性面積比。 結(jié)果： 1．通過高脂飲食和球囊損傷，與建模8周相比，10周和12周組定量股動(dòng)脈造影示球囊損傷處明顯狹窄，血管內(nèi)膜中膜比值增加、泡沫細(xì)胞陽性面積比增加(p=0.0

7、03)，說明兔股動(dòng)脈粥樣硬化模型造模成功。 2．第一部分結(jié)果：自8周、10周到12周，血管斑塊中TF的mRNA水平逐漸增加，分別為6.97％，16.34％和126.72％；同時(shí)，TF觀測(cè)區(qū)域內(nèi)陽染色性面積逐漸增加，分別為507.76±24.43μm<'2>，1504.17±106.51μm<'2>和1805.66±165.02μm<'2>。自8周、10周到12周，血漿內(nèi)TFPI-2的水平在斑塊形成前期無明顯改變，但在12周時(shí)明顯

8、降低，分別為1.52±0.29μg/ml，1.42±0.45μg/ml和1.03±0.09μg/ml。血管斑塊中TFPI-2mRNA表現(xiàn)為前期無明顯變化，12周時(shí)顯著下調(diào)，分別為13.41％，34.67％和0.01％；而TFPI-2觀測(cè)區(qū)域內(nèi)陽性染色面積逐漸增加，分別為656.23±22.46μm<'2>，1530.65±51.37μm<'2>和1873.28±102.55μm<'2>。TFPI-2觀測(cè)區(qū)域陽性面積和TF觀測(cè)區(qū)域陽性面積

9、比值在10周顯著下降，后期沒有顯著變化，分別為1.30±0.09，1.02±0.08和1.04±0.09。此外，自8周、10周到12周，MMP-2的觀測(cè)區(qū)域陽性面積逐漸增加，分別為717.06±92.02μm<'2>，1298.4±150.60μm<'2>和1550.9±256.66μm<'2>。血漿TFPI-2和組織TFPI-2的相關(guān)系數(shù)是-0.607(p=0.002)。 3．第二部分結(jié)果：與球囊損傷對(duì)照組比較，治療組斑塊組織

10、內(nèi)TF mRNA顯著降低，兩者分別為126.72％和0.06％；其TF的觀測(cè)區(qū)域內(nèi)陽性面積由1805.66±165.02μm<'2>下降到876.95±60.75μm<'2>。在12周時(shí)，球囊損傷對(duì)照組血漿內(nèi)TFPI-2的水平明顯較治療組的低，兩者分別為1.03±0.09μg/ml和1.38±0.62μg/ml。與此同時(shí)，丹參多酚酸鹽應(yīng)用后，斑塊組織內(nèi)TFPI-2mRNA顯著上調(diào)，由0.01％增加到0.32％。而其TFPI-2的觀測(cè)區(qū)域

11、內(nèi)陽性染色面積由1873.28±102.55μm<'2>下降到875.73±78.42μm<'2>，兩者存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。此外，治療組MMP-2的觀測(cè)區(qū)域內(nèi)陽性染色面積由1550.9±256.66μm<'2>降低至945.73±123.20μm<'2>。通過形態(tài)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，丹參多酚酸鹽應(yīng)用后，血管內(nèi)膜中膜比值由0.81±0.10下降到0.60±0.07，泡沫細(xì)胞陽性面積比由36.95±6.48％下降到26.63±7.07％。

12、結(jié)論： 1．在兔股動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成過程中，斑塊內(nèi)TF基因及蛋白的表達(dá)均隨著斑塊的增長(zhǎng)而逐漸增加。 2．血漿內(nèi)TFPI-2的水平在斑塊形成前期無明顯改變，但在12周時(shí)明顯降低。斑塊組織內(nèi)TFPI-2mRNA表現(xiàn)為前期無明顯變化，12周時(shí)顯著下調(diào)；但TFPI-2蛋白表達(dá)水平隨斑塊進(jìn)展，伴隨著MMP-2的升高，而逐漸上升。 3．丹參多酚酸鹽應(yīng)用后可降低斑塊組織內(nèi)TF的基因及蛋白表達(dá)，增加血漿TFPI-2的含量。