白念珠菌CYP51免疫原性肽多克隆抗血清的制備與鑒定.pdf

1、白念珠菌是臨床最常見(jiàn)的致病真菌，在系統(tǒng)性真菌感染病例中，有50％-60％的病例是由白念珠菌感染引起的，同時(shí)由于長(zhǎng)期廣泛的預(yù)防性和治療性使用氮唑類抗真菌藥(如氟康唑)，90％以上的白念珠菌一經(jīng)用藥會(huì)出現(xiàn)不同程度的耐藥性。 文獻(xiàn)表明，白念珠菌CYP51蛋白與耐藥作用關(guān)系非常密切。白念珠菌CYP51蛋白即羊毛甾醇14α-去甲基化酶，藥物與CYP51中的血紅素鐵相結(jié)合，阻止酶底物羊毛甾醇及分子氧與CYP51結(jié)合，影響羊毛甾醇14α-甲基

2、的羥基化反應(yīng)，進(jìn)而抑制真菌細(xì)胞膜中的主要甾醇成分麥角甾醇的生物合成，從而產(chǎn)生抗真菌作用。 從基因水平上研究白念耐藥的分子機(jī)理，必須對(duì)相關(guān)基因的蛋白表達(dá)差異進(jìn)行鑒定?？贵w作為體液免疫應(yīng)答的主要效應(yīng)分子，能特異性地識(shí)別和結(jié)合相應(yīng)抗原。過(guò)去的研究證明：通過(guò)免疫組化方法可以研究某個(gè)基因編碼產(chǎn)物．蛋白的組織分布、細(xì)胞內(nèi)定位；通過(guò)免疫共沉淀方法可以知道與它相互作用的蛋白；通過(guò)各種阻斷實(shí)驗(yàn)或中和實(shí)驗(yàn)可以知道蛋白的功能。 本文采用融合蛋

3、白表達(dá)技術(shù)，使用Goldgene等軟件對(duì)CYP51基因的抗原表位進(jìn)行多點(diǎn)預(yù)測(cè)，確定對(duì)應(yīng)于該氨基酸序列的cDNA序列，從而設(shè)計(jì)引物，采用PCR法從白念珠菌基因組中擴(kuò)增出目的基因；選擇常用于融合蛋白表達(dá)的pGEX系列載體，進(jìn)行目的基因片段與質(zhì)粒的切割與連接，成功構(gòu)建了表達(dá)載體；轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞并篩選轉(zhuǎn)化子，同時(shí)通過(guò)選擇最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、最佳收菌時(shí)間和最佳IPTG濃度、探索出了適合GST-CYP51融合蛋白的最佳誘導(dǎo)條件，進(jìn)而培養(yǎng)并誘導(dǎo)融合