運(yùn)用GLGI技術(shù)鑒定白念珠菌LongSAGE標(biāo)簽.pdf

1、白念珠菌是一種重要的條件性致病真菌，在各種真菌感染中占了首位。感染人的粘膜表面可引起鵝口瘡、念珠菌性陰道炎疾?。辉谙到y(tǒng)性疾病的病人和免疫缺陷的人群中，白念珠菌可以引起全身的播散性感染并導(dǎo)致死亡。白念珠菌的毒力因子和發(fā)病機(jī)理有關(guān)，主要包括促進(jìn)白念珠菌粘附于宿主細(xì)胞的生物分子(黏附素)，與侵入有關(guān)的酶SAP(分泌型天冬氨酸蛋白酶)和PL(磷脂酶)，及其菌相轉(zhuǎn)換(生長狀態(tài)，可逆的單個酵母細(xì)胞和菌絲的轉(zhuǎn)換)。并且，菌相轉(zhuǎn)換和抗原表達(dá)的改變有關(guān)。

2、 為更全面的尋找白念珠菌酵母相和菌絲相致病相關(guān)基因及其毒力因子，本實(shí)驗(yàn)室前期應(yīng)用LongSAGE技術(shù)，通過構(gòu)建白念珠菌酵母相和菌絲相細(xì)胞LongSAGE標(biāo)簽庫，來定性定量檢測白念珠菌酵母相和菌絲相細(xì)胞表達(dá)基因的改變，并聚類分析表達(dá)基因功能，探討酵母相和菌絲相細(xì)胞表達(dá)基因與菌相轉(zhuǎn)換、菌株毒力的相關(guān)性。 為了驗(yàn)證LongSAGE標(biāo)簽，我們利用SAGE標(biāo)簽產(chǎn)生長片段cDNA應(yīng)用于基因識別技術(shù)(generationoflonge

3、rfragmentsfromserialanalysisofgeneespression(SAGE)tagsforgeneidentificationGLGI)，將17bp的SAGE標(biāo)簽向3’端擴(kuò)增到數(shù)百bp。17bp的LongSAGE標(biāo)簽作為正向引物，3’端使用的是單一堿基dA、dC或dG與oligo-dT結(jié)合的引物進(jìn)行第1次PCR擴(kuò)增，只有與LongSAGE標(biāo)簽相匹配的序列才能退火并得以擴(kuò)增；在第2次循環(huán)中，只有5’端oligo-d

4、A的前一堿基與錨定的oligo-dT相匹配的序列才能擴(kuò)增，而單純的oligo-dA與oligo-dT結(jié)合的片段因處于錨定狀態(tài)則受抑制，因而最終得到的是含有LongSAGE標(biāo)簽的長片段DNA擴(kuò)增產(chǎn)物，產(chǎn)物長度在200～1000bp之間。 GLGI技術(shù)提供了幾種潛在的結(jié)果。首先，它為LongSAGE技術(shù)提供了發(fā)展策略；其次，結(jié)合應(yīng)用LongSAGE-GLGI技術(shù)可以作為人或其它物種的基因的選擇和表達(dá)；再次，它可以鑒定任何基因的3’端

5、序列的外顯子；最后，結(jié)合應(yīng)用LongSAGE-GLGI技術(shù)可以確定人或其它物種的3’端在基因家族中所表達(dá)基因。 20個多重匹配標(biāo)簽中有15個獲得穩(wěn)定有效的擴(kuò)增，長度在200～1000bp之間，獲得的長片段進(jìn)行序列分析后，有超過95％的堿基與已知基因相同，并且包括原來17bp的SAGE標(biāo)簽，表明獲得的序列為此已知基因。其中酵母相多重匹配標(biāo)簽17是基因PHR1(AF247190)的部分序列，是一個表達(dá)受pH值調(diào)控的基因，該基因的敲除

6、白念珠菌在pH為7的條件下不能形成菌絲。菌絲相多重匹配標(biāo)簽10是AF051313即基因ALS8的部分序列；酵母相多重匹配標(biāo)簽13是U87956即基因ALS3的部分序列；酵母相多重匹配標(biāo)簽11為AF068866即基因ALS5的部分序列。其余獲得擴(kuò)增的LongSAGE標(biāo)簽與白念珠菌結(jié)構(gòu)蛋白相關(guān)。如酵母相多重匹配標(biāo)簽15和與AY497754(18SrRNA的基因)部分序列相同；菌絲相多重匹配的標(biāo)簽9和L28817(5.8SrRNA)的基因部分

7、序列相同；菌絲相多重匹配3和X70659(25SrRNA的基因)的部分序列相同。 20個LongSAGE文庫的無匹配標(biāo)簽中有6個獲得穩(wěn)定有效的擴(kuò)增，其中4個進(jìn)行了測序。經(jīng)過生物信息學(xué)分析，獲得部分序列的信息。①菌絲無匹配標(biāo)簽50經(jīng)擴(kuò)增后獲得的序列經(jīng)過生物信息學(xué)分析后與XM70995(即白念珠菌的推測胞質(zhì)核糖體蛋白質(zhì)的DNA)有88％堿基序列重復(fù)；②菌絲相無匹配標(biāo)簽56經(jīng)擴(kuò)增后獲得的序列分析與X70659(即白念珠菌的25SrRN

8、A的基因)有82％堿基序列重復(fù)；③酵母無匹配標(biāo)簽36經(jīng)過擴(kuò)增后獲得的序列分析與X81697(即白念珠菌乙醇脫氫酶的DNA)有76％堿基序列重復(fù)；④酵母無匹配標(biāo)簽51擴(kuò)增獲得的序列和XM708755有81％堿基序列重復(fù)，其在白念珠菌中為一種蛋白質(zhì)的DNA序列，但這種蛋白質(zhì)的功能是未知的。 研究表明，用SAGE標(biāo)簽作為引物，可有效地識別基因。LongSAGE-GLGI技術(shù)可以用來說明更多的白念珠菌的表達(dá)基因序列和其它真核生物的基因組