內(nèi)毒素對大鼠附睪特異基因Bin1b表達的影響、機制及生物學意義.pdf

1、附睪不僅是精子貯存和運輸?shù)膱鏊?還參與了精子成熟的過程。由于B淋巴細胞的缺失,天然免疫在附睪防御系統(tǒng)中的地位顯得尤為重要。附睪中有這樣一類組織特異性表達的分子,它們具有防御素樣的三葉草結構基序,又能夠與精子結合,執(zhí)行抗微生物入侵和促精子成熟的雙重功能。Bin1b(Spaglle)是中科院張永蓮院士實驗室首先克隆并報道的附睪特異表達蛋白。該實驗室的前期研究發(fā)現(xiàn),Bin1b基因編碼-條68個氨基酸的多肽,結構上屬β防御素超家族成員。Bin1

2、b的表達具有嚴格的空間和時間特異性,它只表達于大鼠附睪頭部中段的上皮細胞中,性成熟時表達豐度最高。Bin1b能有效抑制附睪上皮原代培養(yǎng)上清液中E.coli的生長,還可在附睪不同區(qū)域以不同的方式與精子頭部結合,通過上調(diào)Ca2+誘導未成熟精子的前向運動。盡管目前對Bin1b生理功能的研究已有較大進展,但是對病理狀態(tài)下的變化卻了解的不多。本文首次觀察了大腸桿菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)對大鼠附睪頭部Bin1b和其它

3、12個附睪特異β防御素基因的表達的影響。在發(fā)現(xiàn)LPS能夠下調(diào)附睪中Bin1b和另一些β防御素表達的基礎上,進一步探討了炎癥時Bin1b的表達減少與精子活力改變之間的關系,并在原代培養(yǎng)的大鼠附睪頭部上皮細胞中研究了參與介導Bin1b下調(diào)表達的可能因素,以闡明附睪炎癥條件下Bin1b基因的改變、機制和可能的病理意義。 一、LPS下調(diào)大鼠附睪頭部Bin1b和其它附睪頭部特異性β防御素的表達 采用單側附睪頭部直接注射LPS的方法

4、復制了大鼠附睪炎動物模型,用注射等量生理鹽水的對側附睪作自身對照。H&E染色證實,200μg LPS處理2天可以誘發(fā)單側附睪明顯的炎癥性改變,包括附睪管間隙增寬,間質(zhì)內(nèi)大量白細胞浸潤,以及毛細血管充血。Northern blot方法證實病變側附睪促炎細胞因子IL-1β mRNA的表達也呈LPS劑量和時間依賴性增加,表明附睪炎模型的復制是成功的。在此基礎上,我們采用Northern blot和Western blot的方法觀察了LPS處理

5、對附睪頭部組織中Bin1b表達的影響。結果發(fā)現(xiàn),200μg LPS處理2天,可使Binlb mRNA和蛋白的表達水平減少90％以上(p<0.01)。為明確LPS導致的附睪Binlb下調(diào)是否也發(fā)生在其它附睪特異性β防御素家族成員中,我們又觀察了大鼠附睪頭部特異性表達的其它12個β防御素基因在LPS誘導的炎癥附睪中的表達。結果發(fā)現(xiàn)LPS可以導致附睪頭部11個β防御素基因(Defb12,17,21,25,27,39,41,42,44,51和5

6、2)的表達明顯下調(diào)；只有1個成員(Defb29)的表達不受LPS調(diào)節(jié)。附睪特異性p防御素樣分子雖然是β防御素超家族中的成員,但是它們無論在功能(身兼抗微生物和促精子成熟的雙職)或是表達調(diào)控方面都具有-定的特殊性。與文獻所報道的在其它組織中β防御素往往受炎癥誘導性表達的模式不同,在附睪中LPS不是上調(diào),而是下調(diào)附睪中β防御素基因的表達,提示它們在促精子成熟方面的功能可能更為重要。 二、LPS減少大鼠附睪頭部Binlb表達是導致附睪

7、尾部精子活力下降的重要原因 Binlb能與附睪精子的頭部結合,幫助未成熟精子獲得前向運動能力。因此,我們推測附睪炎時Binlb的表達減少可能會引起精子運動能力的改變,從而導致附睪源性男性不育的發(fā)生。實驗采用計算機輔助精子分析(computer assisted sperm analysis,CASA)的方法,觀察LPS處理后附睪不同區(qū)域精子活力的改變,結果發(fā)現(xiàn)200μgLPS處理2天可明顯降低附睪體、尾部精子的總活力和前向運動率

8、。其中,附睪體部精子的總活力和前向運動率分別減少48.1％和55.8％(p<0.05);尾部精子總活力和前向運動率分別減少49.6％和57.1％(p<0.01)。為證明LPS引起的附睪精子活力下降和Binlb表達減少之間的關系,我們進而將大鼠Binlb表達載體瞬時轉染附睪頭部上皮PCI細胞株獲得了含重組Binlb蛋白的細胞培養(yǎng)上清,用其孵育LPS處理后的附睪尾部精子,結果顯示體外補充重組Binlb蛋白可使精子的總活力和前向運動率較LPS

9、處理后分別增加1.06倍和1.31倍(p<0.01)。免疫熒光化學和流式細胞儀檢測的結果與CASA結果相一致,LPS處理后精子頭部結合的Binlb量明顯減少,補充Binlb蛋白后,Binlb蛋白結合量又恢復至生理鹽水對照側水平,這進一步證明在LPS引起的大鼠附睪炎中,Binlb的表達減少是導致精子活力下降的重要原因之一。 三、附睪頭部上皮細胞存在LPS受體,但是LPS不能直接下調(diào)上皮中Binlb的表達 以上我們證實了在體

10、LPS處理可導致大鼠附睪頭部組織中Binlb的表達下調(diào)。 但是下調(diào)的機制還不清楚,既可能是LPS直接作用于附睪上皮細胞,通過在該細胞中誘發(fā)的信號轉導通路下調(diào)Binlb的表達；也可能是在LPS導致的附睪炎癥反應中,其他因素的改變對上皮細胞的間接作用。由于體內(nèi)參與炎癥的因素很多,內(nèi)環(huán)境復雜,為探討LPS導致Binlb下調(diào)的機制,我們原代分離并培養(yǎng)了大鼠附睪頭部上皮細胞,首先檢測了該細胞的LPS受體和信號轉導通路的反應性,結果顯示,原

11、代培養(yǎng)的附睪頭部上皮細胞表達Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4),且LPS可使原代細胞中IL-1βmRNA的表達呈時間依賴性上調(diào),其中2001μg/ml LPS處理24小時,IL-1βmRNA的表達增加至對照的8.27倍(p<0.01),表明LPS可通過上皮細胞中的自身受體和激活的信號轉導通路誘導下游靶基因的表達。我們繼而觀察了LPS對該細胞中Binlb表達的影響,結果發(fā)現(xiàn)與生理鹽水處理的對照細胞相比,

12、用不同濃度的LPS處理0-2天,原代細胞中Binlb的表達并沒有明顯改變,說明LPS在體內(nèi)下調(diào)Binlb的表達,并不是通過與附睪上皮細胞的直接作用,而是一種間接的作用的結果。如LPS通過增加對Binlb表達具有抑制作用的因子,或者減少能促進Binlb表達的因子導致該基因的下調(diào),這方面的研究有待于進一步深入。 四、雄激素能上調(diào)原代培養(yǎng)的附睪頭部上皮細胞中Binlb的表達,而雌激素和糖皮質(zhì)激素沒有調(diào)節(jié)作用 在原代培養(yǎng)的附睪頭

13、部上皮細胞中,我們還意外地發(fā)現(xiàn)Binlb mRNA的表達隨培養(yǎng)時間延長而逐步減少,培養(yǎng)5天后的附睪上皮細胞中幾乎測不到其表達。這提示可能在體內(nèi)某些未知的Binlb表達誘導因子在體外培養(yǎng)液中缺少或者濃度降低,從而不足以維持Binlb的表達。已知一些附睪蛋白的表達受甾體激素的調(diào)節(jié),因此我們觀察了不同濃度的雄激素-二氫睪酮(dihydrotestosterone,DHT),雌激素-雌二醇(estradiol,E2)和糖皮質(zhì)激素-地塞米松(de

14、xamethasone,Dex)單獨作用對Binlb表達的影響,結果發(fā)現(xiàn)不同濃度的DHT處理后,Binlb mRNA表達量較對照組均明顯增加(p<0.05),其中10-9M的DHT可使Binlb表達比對照細胞增加約30％,而E2或Dex處理的細胞Binlb mRNA的表達與對照相比沒有明顯的差別,這表明雄激素能上調(diào)Binlb的表達,而雌激素或糖皮質(zhì)激素則無此作用。盡管雄激素有上調(diào)Binlb的作用,但是在體外雄激素單獨作用并不足以維持Bi

15、nlb在體內(nèi)的表達水平,提示體內(nèi)除了雄激素外,還存在其他能夠上調(diào)Binlb表達的因子,尋找這些調(diào)節(jié)因子是今后要開展的工作。 同樣的體外培養(yǎng)衰減表達模式也存在于附睪頭部特異β防御素Defb21中。巧合的是,Defb21在LPS處理后的附睪組織中的表達也呈時間和劑量依賴性下調(diào),而另-個附睪頭部特異β防御素Defb29在附睪組織的表達不受LPS調(diào)節(jié),在原代培養(yǎng)過程中其mRNA的表達量在所觀察的時間內(nèi)也不發(fā)生衰減。LPS導致的Binlb

16、表達下調(diào),是否有可能與維持其生理性表達的因子在炎癥時的水平下降有關,值得進一步研究。 綜上所述,我們發(fā)現(xiàn)LPS可以抑制大鼠附睪頭部Binlb基因的表達,使附睪精子與Binlb蛋白的結合減少,從而影響精子成熟過程,使附睪尾部精子運動能力降低。并且,LPS誘導的下調(diào)表達可能還是附睪特異表達的β防御素樣分子在炎癥時普遍存在的一種調(diào)節(jié)模式。附睪頭部上皮細胞表達TLR4受體,LPS刺激能誘導上皮細胞中IL-1β mRNA的表達,但LPS下

17、調(diào)組織中Binlb表達的主要機制并非通過與上皮細胞的直接作用。在原代培養(yǎng)的附睪頭部上皮細胞中,Binlb mRNA的表達呈時間依賴性減少,DHT對該細胞中Binlb的表達有一定上調(diào)作用,但并不能完全逆轉這種時間依賴性表達減少的趨勢,E2或Dex單獨處理對該細胞中Binlb的表達沒有影響。以上發(fā)現(xiàn)將有助于更深入地了解β防御素樣附睪特異蛋白在炎癥和精子成熟過程中的病理生理作用,幫助闡明附睪炎與男性不育之間的關系,并可能為附睪源性男性不育和性