對白血病化療藥物左旋天冬酰胺酶Ⅱ的熱穩(wěn)定性改造以及微小殘留白血病DNA疫苗的構(gòu)建、純化和免疫效果研究.pdf

1、中國協(xié)和醫(yī)科大學博士學位論文對白血病化療藥物左旋天冬酰胺酶Ⅱ的熱穩(wěn)定性改造以及微小殘留白血病DNA疫苗的構(gòu)建、純化和免疫效果研究姓名：李亮助申請學位級別：博士專業(yè)：生物化學與分子生物學指導教師：孫茂盛;邵一鳴20080401北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)學生物學研究所博一l ：研究生學位論文摘 要在治療急性淋巴細胞白血病的臨床實踐中有兩個長期困擾人們的難題：一個是化療藥物的副作用問題；另一個是導致白血病完全緩解后又不斷復發(fā)的腫瘤細胞微小殘留問題。本課

2、題針對這兩個問題進行了初步的探索。在急性淋巴細胞白血病的化療方案中，左旋大腸桿菌天冬酰胺酶I I 是重要的藥物組成部分。但是該酶具有較大的副作用，同時由于其相對較短的半衰期和熱不穩(wěn)定性，使得該藥在實際治療中需要進行頻繁地注射，結(jié)果使病人產(chǎn)生了更大的痛苦。因此在本研究課題中對如何提高該酶的熱穩(wěn)定性以便進一步提高其半衰期進行了初步研究：通過生物信息學分析手段確定了天冬酰胺酶蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中一個與熱穩(wěn)定性關(guān)系密切的B ．轉(zhuǎn)角，并用定點突變的方

3、法將該轉(zhuǎn)角上的第1 7 8 位的天冬氨酸突變?yōu)楦彼帷嶒灲Y(jié)果顯示：與野生型酶相比，突變體酶在不同溫度條件下的熱穩(wěn)定性得到了提高；從能量角度上看，改造后的酶在保持動力學性質(zhì)( K m 和‰) 基本不變的同時活化能得到了增加。這說明筆者對左旋天冬酰胺酶的改造在不影響酶活性的前提下提高了其熱穩(wěn)定性。對于化療和骨髓移植不能徹底解決的白血病細胞微小殘留問題，本課題對相應的免疫學解決方案進行了探索。雖然腫瘤細胞疫苗在目前來說是一種較有前景的免疫治

4、療形式，但出于對其安全性方面考慮，筆者決定嘗試用另外一種相對安全的免疫形式——D N A 疫苗，來治療微小殘留白血病，并對其免疫效果進行了初步研究。本課題采用雙質(zhì)粒系統(tǒng)，其中一個質(zhì)粒表達經(jīng)過改造滅活的腫瘤細胞特異性超表達抗原生存素( s u r v i v i n ) 和能特異性引起T h l 細胞免疫反應的發(fā)夾狀單鏈R N A ( s s R N A ) ：另一個質(zhì)粒表達細胞因子G M ．C S F 和共刺激分子C D 8 0 。結(jié)果

5、證明用該D N A 疫苗系統(tǒng)免疫B a l B ／C 小鼠能引起較強的細胞免疫應答，誘導較強的T 細胞增殖和對腫瘤細胞的C T L 殺傷活力。這些結(jié)果為進一步研究D N A 疫苗對微小殘留白血病的實際治療提供了前期實驗室數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。D N A 疫苗大規(guī)模純化技術(shù)的研發(fā)是D N A 疫苗走向?qū)嶋H臨床應用和工業(yè)化生產(chǎn)的必不可少的環(huán)節(jié)。本課題重點對利用排阻層析純化質(zhì)粒的技術(shù)進行了研究。筆者對不同種類及不同濃度鹽緩沖液存在時，各種核酸分子排阻層析