LIM礦化蛋白-1（LMP-1）對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：通過(guò)構(gòu)建LIM礦化蛋白．1(LMP—1)的真核表達(dá)質(zhì)粒，并使其在分離培養(yǎng)的兔骨髓問(wèn)充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)內(nèi)表達(dá)，研究LMP一1對(duì)體外培養(yǎng)BMSCs成骨分化的影響。 方法：采用RT-PCR的方法分別從人的胎盤組織和含有人BMP-2的重組質(zhì)粒中，克隆LMP一1和BMP-2，與真核表達(dá)質(zhì)粒pIRES2-EGFP酶切連接，構(gòu)建plRES2-EGFP-LMPl及pIRES2-EGFP-BMP2重組質(zhì)粒。采用梯度離心方法從兔骨髓中分

2、離培養(yǎng)BMSCs。以第三代細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，脂質(zhì)體介導(dǎo)下分別將plRES2-EGFP-LMPl、pIRES2-EGFP-BMP2和pIRES2-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，7天后收集細(xì)胞檢測(cè)其生物學(xué)性狀的變化。RT-PCR比較LMP—l、BMP-2及I型膠原的表達(dá)，堿性磷酸酶活性檢測(cè)ALP活性，免疫組化染色比較骨鈣素表達(dá)。 結(jié)果：經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定plRES2-EGFP-LMPl和plRES2-EGFP-BMP2

3、重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。成熟的體外分離培養(yǎng)BMSCs方法方便簡(jiǎn)單，收獲細(xì)胞數(shù)量多且增殖能力強(qiáng)。脂質(zhì)體介導(dǎo)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSCs后，通過(guò)熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染成功且轉(zhuǎn)染效率15％左右。收集細(xì)胞RT-PCR證實(shí)表達(dá)目的基因，LMP一1和BMP-2轉(zhuǎn)染組可以明顯促進(jìn)細(xì)胞分泌ALP的活性，誘導(dǎo)I型膠原和骨鈣素的表達(dá)。 結(jié)論：成功構(gòu)建plRES2-EGFP-LMPl和pIRES2-EGFP-BMP2重組質(zhì)粒。分別轉(zhuǎn)染BMSCs后表達(dá)目的基因，比較轉(zhuǎn)