乙酰膽堿酯酶在人牙周膜細(xì)胞中的表達(dá)和尼古丁與α-銀環(huán)蛇毒素對(duì)其表達(dá)的影響.pdf

1、牙周炎以細(xì)菌誘發(fā)為始動(dòng)因子，需在宿主、環(huán)境、遺傳等因素共同作用下導(dǎo)致發(fā)病。大量研究已經(jīng)證明，吸煙能極大地增加牙周破壞的風(fēng)險(xiǎn)，是牙周炎的危險(xiǎn)因素。然而，到目前為止，吸煙對(duì)牙周組織的破壞機(jī)制、對(duì)牙周炎發(fā)生發(fā)展過(guò)程的影響仍不明了。尼古丁是煙草的主要成分，有學(xué)者推測(cè)，尼古丁可能在牙周炎的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。
　　非神經(jīng)乙酰膽堿能系統(tǒng)包含：乙酰膽堿，乙酰膽堿酯酶，膽堿乙酰基轉(zhuǎn)移酶，煙堿型乙酰膽堿受體和毒蕈堿型乙酰膽堿受體及乙酰膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)體。

2、研究認(rèn)為，尼古丁作為煙草的主要化學(xué)物質(zhì)之一，是非神經(jīng)乙酰膽堿能系統(tǒng)中煙堿型乙酰膽堿受體的特異性配體。尼古丁與細(xì)胞膜上的煙堿型乙酰膽堿受體特異性結(jié)合后，經(jīng)細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，產(chǎn)生效應(yīng)。也就是說(shuō)，作為煙堿型乙酰膽堿受體特異性配體的尼古丁，可以代替乙酰膽堿，侵入局部非神經(jīng)乙酰膽堿能系統(tǒng)的網(wǎng)絡(luò)，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。已有研究報(bào)道在人牙齦上皮細(xì)胞中存在非神經(jīng)乙酰膽堿能系統(tǒng)。我們前期研究證實(shí)，人牙周膜成纖維細(xì)胞（human periodontal liga

3、ment fibroblasts，人PDLF）中存在煙堿型乙酰膽堿受體，且尼古丁可上調(diào)該受體表達(dá)。然而，人PDLF中是否存在完整的非神經(jīng)乙酰膽堿能系統(tǒng)，尼古丁是否通過(guò)該系統(tǒng)發(fā)揮作用，目前尚不清楚。
　　本實(shí)驗(yàn)所用藥物為尼古丁以及α-銀環(huán)蛇毒素（α-BTX）。其中，α-BTX是煙堿型乙酰膽堿受體α7亞型（α7nAChR）的特異性拮抗劑，能夠特異性結(jié)合人體內(nèi)α7nAChR。
　　本研究采用細(xì)胞培養(yǎng)、免疫熒光、蛋白印跡等方法觀察人

4、PDLF中是否存在非神經(jīng)乙酰膽堿能系統(tǒng)的另一重要成員—乙酰膽堿酯酶，以及尼古丁對(duì)該酶的影響，旨在從另一方面探討尼古丁對(duì)非神經(jīng)乙酰膽堿能系統(tǒng)的作用，有助于闡明吸煙相關(guān)性牙周炎發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制。
　　第一部分：實(shí)驗(yàn)人牙周膜成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng)及鑒定
　　1、主要方法：
　　取因正畸治療需要拔除的12-14歲健康人前磨牙，無(wú)菌條件下刮取根中1/3牙周膜組織，采用組織塊法進(jìn)行原代培養(yǎng)，待原代培養(yǎng)成功后，常規(guī)傳代，免疫組化方法

5、進(jìn)行抗波形絲蛋白、抗角蛋白染色，顯微鏡下觀察。
　　2、主要結(jié)果：
　　倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)情況。細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底，密度均勻，呈星形或長(zhǎng)梭形，細(xì)胞胞漿均勻，細(xì)胞質(zhì)豐滿，細(xì)胞核為圓形，細(xì)胞排列呈旋渦狀或放射狀。免疫組化結(jié)果顯示培養(yǎng)細(xì)胞抗波形絲蛋白染色陽(yáng)性，抗角蛋白染色為陰性。
　　3、主要結(jié)論：
　　本實(shí)驗(yàn)所培養(yǎng)細(xì)胞為來(lái)源于中胚層的人PDLF。
　　第二部分：實(shí)驗(yàn)免疫熒光檢測(cè)人牙周膜成纖維細(xì)胞中是否