中國萊姆病螺旋體MLVA分型方法的建立與研究.pdf

1、目的：
　　建立適合中國萊姆病螺旋體（又稱伯氏疏螺旋體）的多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析（multi-locusvariablenumbertandemrepeatanalysis,MLVA）基因分型方法，對來自中國12個省45個地區(qū)的95株伯氏疏螺旋體進(jìn)行MLVA分型鑒定和聚類分析，探討中國伯氏疏螺旋體菌群特征，并為萊姆病的分子流行病學(xué)調(diào)查，疫情溯源及菌群進(jìn)化分析提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.MLVA

2、是一種以可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列（variablenumbertandemrepeat,VNTR）為基本單位的，根據(jù)每個位點(diǎn)VNTR在不同菌株中的多態(tài)性即拷貝數(shù)的差異，形成VNTR分辨率，通過VNTR分辨率的可疊加性以獲得對菌株的最佳分辨效果的基因分型方法。
　　2.使用TandemRepeatsFinder基因掃描軟件掃描中國優(yōu)勢菌種Borreliagarinii的國際參考菌株P(guān)Bi的904.246kb染色體基因和質(zhì)粒（CP26和L

3、P54）基因，分析基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，篩選多個潛在的VNTR位點(diǎn)。
　　3.利用PCR（PolymeraseChainReaction）技術(shù)檢驗(yàn)潛在VNTR位點(diǎn)的普遍擴(kuò)增性和特異性差異的分辨能力。
　　4.通過STR（ShortTandemRepeat）測序收集VNTR信息并建立菌株VNTR譜。
　　5.聚類分析，用BioNumerics5.1軟件處理數(shù)據(jù),用Categorical系數(shù)和UPGMA（UnweightedPai

4、r-GroupMethodwithArithmetic，非加權(quán)算術(shù)平均法）進(jìn)行聚類分析，初步建立萊姆病螺旋體的MLVA分型方法，進(jìn)而對95株中國菌株和6株國際參考株進(jìn)行MLVA分型研究，并與多位點(diǎn)序列分析（multi-locussequenceanalysis,MLSA）的基因分型結(jié)果進(jìn)行比較。
　　結(jié)果：
　　1.篩選出5個VNTR位點(diǎn)進(jìn)行組合，建立萊姆病螺旋體的MLVA方法。將101株萊姆病螺旋體分為51個獨(dú)立的基因型，

5、4個明顯的基因簇，即Borreliaburgdorferisensustricto,Borreliagarinii,Borreliaafzelii,Borreliavalaisiana。分型結(jié)果與MLSA基因分型結(jié)果一致。
　　2.全部5個VNTR位點(diǎn)（VNTR-1,VNTR-2,VNTR-3,VNTR-4,和VNTR-5）對應(yīng)的等位基因種類數(shù)分別為7,3,9,7和6；相應(yīng)的位點(diǎn)多態(tài)性指數(shù)為0.79,0.22,0.77,0.71和

6、0.67；5個VNTR位點(diǎn)分辨率疊加，多態(tài)性指數(shù)達(dá)0.96。
　　結(jié)論：
　　1.建立了一種適合中國萊姆病螺旋體菌株的MLVA基因分型的方法。MLVA分型方法操作簡單，分型穩(wěn)定，重復(fù)性好，分型結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
　　2.聚類分型結(jié)果表明中國萊姆病螺旋體表現(xiàn)出廣泛的遺傳異質(zhì)性，存在Borreliaburgdorferisensustricto,Borreliagarinii,Borreliaafzelii,Borreliav