涎腺分泌蛋白Salp15對(duì)全溝硬蜱傳播萊姆病螺旋體效能的影響.pdf

1、為了吸取宿主的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),蜱吸血過(guò)程中會(huì)分泌涎液?涎液能夠阻礙宿主凝血,抑制宿主的炎癥反應(yīng)并改變其免疫應(yīng)答,最終也影響著其作為媒介傳播病原的能力?涎腺激促的病原體傳播(Salivaryactivetransmission,SAT)是蜱媒病傳播的主要方式,分離及鑒定涎腺中具有生物活性的物質(zhì),將是明確媒介蜱與病原及宿主之間的關(guān)系的必須步驟,對(duì)于揭示蜱類(lèi)傳播病原體的生理機(jī)制具有十分重要的科學(xué)機(jī)制,也將可從傳播阻斷角度開(kāi)發(fā)新型疫苗以應(yīng)對(duì)層出不窮的

2、蜱媒疾病。本文基于全溝硬蜱對(duì)多種病原體,如細(xì)菌、原蟲(chóng)、病毒、立克次體等的高效傳播能力,以萊姆病為蜱媒病代表,通過(guò)對(duì)全溝硬蜱的涎腺蛋白Salp15編碼序列的克隆、原核表達(dá)得到涎腺蛋白Salp15,利用動(dòng)物免疫和實(shí)驗(yàn)傳播來(lái)探討全溝硬蜱涎腺在萊姆病螺旋體感染和傳播中的地位和作用,以期揭示蜱類(lèi)涎腺對(duì)病原體的作用機(jī)制,繼而從傳播阻斷角度探索利用涎腺蛋白阻斷蜱媒病原體傳播的可能性和可行性。
　　1.全溝硬蜱復(fù)合組Salp15蛋白超家族多樣性<

3、br>　　本文利用涎腺RNA逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)研究了Salp15蛋白在全溝硬蜱涎腺的基因編碼。轉(zhuǎn)錄及表達(dá)情況,結(jié)果表明,全溝硬蜱的Salp15基因僅在叮咬吸血階段轉(zhuǎn)錄,而在非叮咬的狀態(tài)下未檢測(cè)到轉(zhuǎn)錄;對(duì)吸血期全溝硬蜱的檢測(cè),獲取了全溝硬蜱5條唾液腺蛋白Salp15序列:Ipers-2、Ipers-3、Ipers-4、Ipers-1、Ipers-5,其中于幼蜱中擴(kuò)增出Ipers-2、Ipers-3、Ipers-4,若蜱中擴(kuò)增出Ipers-1,成蜱

4、中擴(kuò)增出Ipers-5;經(jīng)氨基酸序列相似性比較,Ipers-3與篦子硬蜱的iric-3相似性最大,達(dá)94.4％,Ipers-2與Ipers-3相似性其次達(dá)89.1%,Ipers-2與iric-2相似性最小為53.1%;一種蜱中可以同時(shí)表達(dá)多種Salp15蛋白成員,即呈現(xiàn)出多樣性。結(jié)合全溝硬蜱復(fù)合組其他成員的Salp15的轉(zhuǎn)錄情況(如本課題組完成的中華硬蜱的轉(zhuǎn)錄情況),綜合分析,Salp15的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)是多樣性的。
　　2.全溝硬蜱

5、涎腺分泌蛋白Salp15的融合表達(dá)
　　為了應(yīng)對(duì)分泌型蛋白表達(dá)的特殊性,本文在對(duì)Salp15蛋白序列的分析和預(yù)測(cè)的基礎(chǔ)上,通過(guò)添加MBP標(biāo)簽序列的的策略,以pMal-c4x載體為基骨構(gòu)建了重組表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染大腸桿菌TransettaDE3細(xì)胞后實(shí)現(xiàn)了salp15蛋白的表達(dá),并得到了Western-blotting法特異性檢測(cè)驗(yàn)證,該融合蛋白Ipers-5親和層析純化后,濃度達(dá)到1.2mg/ml,純度達(dá)到93%、FactorXa酶切

6、去除融合蛋白的MBP標(biāo)簽后,得到了與預(yù)期分子量大小一致的蛋白片段15kDa,為之后的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)及傳播阻斷實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。
　　3.Salp15蛋白Ipers-5對(duì)螺旋體的傳播阻斷效應(yīng)初步評(píng)價(jià)
　　以螺旋體敏感系C3H鼠作為免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,兩種螺旋體菌株BorreliaburgdorferisenselatoB31,BorreliagariniiNMJW-1為實(shí)驗(yàn)菌株、通過(guò)腹腔注射及蜱蟲(chóng)叮咬傳播的方法傳染螺旋體,非免疫組小鼠皆檢

7、測(cè)到高載量的螺旋體,而免疫組中的螺旋體感染量顯著降低,初步展示了Salp15抗體對(duì)螺旋體感染和傳播的阻斷作用。
　　綜上所述:全溝硬蜱涎腺Salp15基因僅在吸血階段轉(zhuǎn)錄或表達(dá),Salp15基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)在不同發(fā)育階段轉(zhuǎn)錄有差異性,導(dǎo)致了Salp15蛋白多樣性的產(chǎn)生。利用pMal-c4x重組表達(dá)和質(zhì)粒和大腸桿菌TransettaDE3,可成功表達(dá)Salp15蛋白。所表達(dá)的Salp15蛋白能夠有效誘導(dǎo)C3H小鼠高滴度的抗體產(chǎn)生;萊