天花粉蛋白抑制人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231生長及逆轉(zhuǎn)syk基因甲基化的研究.pdf

1、目的：本研究從細(xì)胞分子水平研究中藥天花粉蛋白（TCS）的抗腫瘤和逆轉(zhuǎn)syk基因甲基化的作用及其作用機(jī)制，尋找新的抗腫瘤和去甲基化藥物。
　　 方法：1.采用MTT法分析不同濃度TCS作用不同時(shí)間后，人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231增殖反應(yīng)的變化；
　　 2.采用Giemsa染色技術(shù)觀察TCS作用前后MDA-MB-231細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；瓊脂糖凝膠電泳分析TCS（20μg/ml）處理48h后MDA-MB-231細(xì)胞的DNA梯

2、度降解（DNA Ladder）變化，分析TCS對(duì)細(xì)胞凋亡的影響；
　　 3.采用流式細(xì)胞技術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測(cè)不同濃度TCS作用48h后，MDA-MB-231細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期分布情況；
　　 4.采用甲基化特異性PCR（MSP）技術(shù)檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞經(jīng)20μg/mlTCS作用48h前后syk基因甲基化狀況的改變；
　　 5.RT-PCR方法分析MDA-MB-231細(xì)胞經(jīng)20μ

3、g/mlTCS作用48h前后syk、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶Dnmts、去甲基轉(zhuǎn)移酶MBD2 mRNA表達(dá)量的變化；
　　 6.使用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性檢測(cè)試劑檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞經(jīng)20μg/ml TCS作用48h前后DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性變化狀況。
　　 結(jié)果：1.中藥天花粉蛋白（TCS）體外對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231增殖反應(yīng)具有顯著抑制作用（p<0.05），并呈時(shí)間和濃度依賴性，藥物濃度越大、作用時(shí)間越長，抑制

4、效應(yīng)越強(qiáng)。10、20、40、80、100μg/ml的TCS分別處理MDA-MB-231細(xì)胞24、48、72h后，抑制率最高可達(dá)77.74±0.539％。
　　 2.TCS作用于MDA-MB-231細(xì)胞后，可誘導(dǎo)典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)變化，如細(xì)胞體縮小，胞質(zhì)濃縮，空泡樣變性，有的細(xì)胞出現(xiàn)核固縮，核碎裂等典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)特征；經(jīng)20μg/mlTCS作用48h后，MDA-MB-231細(xì)胞DNA出現(xiàn)明顯的梯度圖象（DNA Ladder），

5、提示細(xì)胞發(fā)生凋亡；
　　 3.流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示，TCS能使MDA-MB-231細(xì)胞發(fā)生凋亡和生長周期阻滯，凋亡率隨著時(shí)間和濃度的增加而增加，細(xì)胞生長周期阻滯在S期；
　　 4.MSP法分析MDA-MB-231細(xì)胞經(jīng)TCS作用前，syk基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化，經(jīng)20μg/mlTCS作用48h后，MDA-MB-231細(xì)胞syk基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀況逆轉(zhuǎn)；RT-PCR法分析結(jié)果顯示MDA-MB-231 syk mRNA表達(dá)陰性

6、，經(jīng)20μg/mlTCS作用48h后，syk mRNA表達(dá)陽性；MDA-MB-231細(xì)胞經(jīng)20μg/mlTCS作用48h前后甲基轉(zhuǎn)移酶Dnmts、去甲基轉(zhuǎn)移酶MBD2 mRNA表達(dá)量沒有明顯變化（p>0.5）；
　　 5.MDA-MB-231細(xì)胞經(jīng)20μg/mlTCS作用48h后，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶Dnmts活性降低（p<0.5）。
　　 結(jié)論：1.中藥天花粉蛋白（TCS）體外能明顯抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖。