血管內皮祖細胞的分離培養(yǎng)分化及其高血壓病的相關性研究.pdf

1、第一部分、骨髓源性血管內皮祖細胞分離、培養(yǎng)及分化為內皮細胞的研究
　　目的:隨著國內外對干細胞研究的不斷深入，干細胞所介導的血管新生已成為心血管再生領域的研究熱點。血管內皮祖細胞(endothelialprogenitor cells，EPCs)是其中研究最廣泛、最深入的一類干細胞。骨髓是外周血循環(huán)中EPCs的主要來源，在一定條件下可得到動員并分化為成熟血管內皮細胞，參與到血管的修復或再生過程中。
　　EPCs具有多種分化潛

2、能，可以誘導分化為內皮細胞、平滑肌細胞。目前，EPCs在自體和異體移植方面都取得了一定程度的成功，EPCs分化為成熟內皮細胞后可修復血管內皮組織，加快損傷的血管再內皮化，抑制病理性內膜形成，促進心肌梗死后新生血管和側枝循環(huán)的形成，從而從理論上起到改善高血壓和治療心肌梗死的目的。
　　國外對于EPCs的實驗研究已經比較深入，但國內對EPCs的研究仍處于起步階段。內皮祖細胞主要從骨髓、臍帶血及外周血中獲得，外周血來源的EPCs因損傷小

3、、易獲取而被廣泛使用，但所獲得的EPCs純度較低。本研究旨在探索一種有效的骨髓源性EPCs的體外分離、擴增培養(yǎng)、誘導分化方法，并對其形態(tài)學、組織化學及功能進行鑒定，從而為臨床上進行性缺血性疾病的替代治療奠定細胞學基礎。
　　方法:抽取SD大鼠骨髓細胞，采用密度梯度離心法提取骨髓液中單個核細胞，用含有血管內皮細胞生長因子(vascular endothelial cell growthfactor, vEGF)、表皮細胞生長因子(e

4、pidermal growth factor, EGF)、堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）的培養(yǎng)液誘導培養(yǎng)EPCs，形態(tài)學觀察EPCs的生長分化過程，對培養(yǎng)后的細胞采用免疫熒光染色鑒定細胞表面標志物，同時，根據RT-PCR法檢測EPCs特異性分子標志，并進行EPCs向內皮細胞誘導分化及檢測。
　　結果:培養(yǎng)24h后細胞開始貼壁，4d后細胞呈集落樣生長，細胞從集落中央

5、向外周生長，至培養(yǎng)的第7d成片生長的細胞集落相互連接，10d后細胞形態(tài)明顯改變，由原來的梭型逐漸縮短、變圓，類似成熟血管內皮細胞形態(tài)，呈現典型的“鵝卵石樣”外觀。貼壁細胞免疫熒光檢測結果為CD34(+)，CD133(+)，VEGFR-2(+)，FGFR1(+)，陽性率分別為（56.23±0.18）％、(87.23±1.66)％、（90.64±0.87）％、(89.78±0.99)％。RT-PCR法檢測EPCs特異性分子標志均為陽性表達。

6、經內皮誘導液誘導10天后，細胞形態(tài)變?yōu)榈湫偷涅Z卵石樣結構，免疫熒光檢測CD144、CD31陽性。
　　結論:采用密度梯度離心法可獲得骨髓單個核細胞，在培養(yǎng)液中可擴增出具有典型特征的EPCs，呈貼壁增殖狀態(tài)，并有分化能力，可在體外誘導分化為成熟的血管內皮細胞。
　　第二部分、原發(fā)性高血壓對循環(huán)中血管內皮祖細胞的影響作用
　　目的:血管內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)多來源于

7、骨髓，在一定條件下可以動員到外周血循環(huán)，分化為成熟的血管內皮細胞，參與血管內皮的修復和新生血管的形成。他汀類藥物能夠通過提高NO活性來改善內皮細胞的功能，能夠起到動員EPCs的作用。
　　與此相反，大量實驗已證實高血壓、動脈粥樣硬化、血脂紊亂、糖尿病、冠心病等危險因素可降低循環(huán)內EPCs的數量和功能。而高血壓可以作為一個獨立的危險因素對血管內皮細胞造成損害，同時促進動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展，具有極大的危害性。
　　目前，原發(fā)

8、性高血壓與EPCs的關系尚未完全研究清楚，本研究旨在探討原發(fā)性高血壓未完全控制狀態(tài)下或理想控制狀態(tài)下，患者外周循環(huán)內的EPCs經體外培養(yǎng)后在細胞數量、粘附能力、增殖能力及細胞凋亡率等方面是否存在差異。
　　方法:納入60例研究對象，其中原發(fā)性高血壓患者40例，20例為血壓控制未達標者，另20例為血壓控制達標者，另選取20例在年齡、性別上相匹配的健康成年人為對照組。所有研究對象的血糖、血脂、基礎代謝率(BMI)均在正常范圍內，且無靶

9、器官損害情況。從肘正中靜脈采集研究對象外周血5 ml進行EPCs的分離、培養(yǎng)，1周后以乙?；兔芏戎鞍?DiI-acLDL)和荊豆凝集素1（FITC-UEA-1）進行雙染色熒光標記鑒定，在共聚焦顯微鏡下計數EPCs數量;以TUNEL法測算EPCs的凋亡率，同時采用MTT比色試驗測定EPCs增殖能力，粘附試驗檢測細胞的粘附能力。
　　結果:接種后的單個核細胞呈圓形，大小不一，24h后部分細胞開始貼壁，細胞變大，漸伸展，呈長梭形;培

10、養(yǎng)72h后貼壁細胞明顯增多，4～7d細胞生長迅速，核分裂相明顯，貼壁細胞呈典型的長梭形，有的細胞首尾相連呈條索狀或線狀排列。第9～11天，細胞長滿培養(yǎng)板。
　　與正常對照組比較，血壓控制達標組和血壓控制未達標組患者在EPCs數量、增殖能力、凋亡率和黏附能力方面均有統計學差異（P＜0.05）;在EPCs數量、增殖能力和凋亡率等方面，血壓控制未達標組與血壓控制達標組比較均有統計學差異(P＜0.05)，但兩組間的黏附能力比較無明顯統計學

11、意義(P＞0.05)。
　　結論:原發(fā)性高血壓患者外周血EPCs的數量減低、功能受損，從而使血管內皮細胞的修復出現障礙;待血壓獲得良好控制后，細胞數量和增殖能力均獲得一定程度恢復，細胞凋亡率亦降低;故良好的血壓控制，可增加EPCs的修復能力，最大程度維持對靶器官的保護和修復作用。
　　第三部分、阿托伐他汀對高血壓患者外周血內皮祖細胞數量和功能的影響
　　目的:內皮祖細胞(endothelial progenitor c

12、ells，EPCs)廣泛存在于骨髓、臍血、胎肝及外周血等多種組織中，參與缺血組織血管的新生、損傷內皮的修復，抑制血管內膜修復時的過度增厚。高血壓作為心腦血管疾病的獨立危險因素，可導致血管內皮細胞損傷，從而需要動員更多的EPCs來補充修復損傷的血管內皮。
　　由于外周血循環(huán)中EPCs具有獨特的血管內皮修復功能，故與高血壓有關的外周血EPCs生物學研究受到越來越多專家學者的重視。從外周血中獲取EPCs較骨髓、臍血更方便，且來源相對更充

13、足，因此從外周血中分離培養(yǎng)EPCs成為當今研究的熱點。
　　他汀類藥物除具有降總膽固醇、降低密度脂蛋白膽固醇、延緩動脈粥樣硬化進展、抑制血小板聚集、降低C反應蛋白外，還可以改善血管內皮功能。已有研究表明，辛伐他汀類藥物有促進體外培養(yǎng)的EPCs進行增殖的作用，同時，亦提高祖細胞的遷移能力，減少凋亡，增強細胞趨化活性。本研究通過分離服用阿托伐他汀的高血壓患者外周血中的EPCs，并進行體外培養(yǎng)，觀察阿托伐他汀對高血壓患者EPCs數量是否

14、有影響。
　　方法:選取原發(fā)性高血壓患者50例，隨機分為常規(guī)降壓藥物組（常規(guī)組，n=25）和常規(guī)降壓藥物聯合阿托伐他汀組（實驗組，n=25），另選取10名年齡、性別上相匹配的健康志愿者（對照組，n=10），所有人員口服阿托伐他汀8周。分別于治療前和治療8周后從受試個體的肘正中靜脈采集外周血10ml，進行EPCs的分離培養(yǎng)，在倒置相差顯微鏡下計數EPCs克隆數量，進而評估外周血EPCs水平。
　　結果:常規(guī)組和實驗組治療8周后

15、收縮壓較前均有顯著降低，組內比較差異有統計學意義(P＜0.05);常規(guī)組收縮壓平均降低（32.2±7.5）mmHg，實驗組平均降低(38.2±7.9) mmHg，組間比較差異具有顯著性(P＜0.05)。對照組服藥前后收縮壓比較差異無統計學意義(P＞0.05)。服藥8周后，常規(guī)組內皮祖細胞克隆形成單位(EPC-CFU)由（7.9±1.7）升高到（11.5±2.1），實驗組EPC-CFU由(8.1±1.9)升高到（12.9±2.5），服藥前

16、后比較差異均有統計學意義(P＜0.05);兩組EPC-CFU升高值分別為（3.6±0.6）和（4.9±0.8），具有顯著性差異(P＜0.05)。對照組治療前后EPC-CFU由（13.8±2.7）升高到(16.1±2.9)，差異有統計學意義(P＜0.05)。該組EPC-CFU平均增加數為(2.2±0.5)，與實驗組比較差異具有統計學意義(P＜0.05)。
　　結論:原發(fā)性高血壓可引起外周血EPCs數量減低，待血壓降低后EPCs數量可