pHIF-1α-EGFP-C-,2-質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定.pdf

1、目的：缺氧誘導(dǎo)因子—1(hypoxia—inducible factor—1，HIF—1)是在缺氧狀態(tài)下特異性發(fā)揮活性的核轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在于缺氧條件下的哺乳動(dòng)物和人體組織細(xì)胞內(nèi)，可以調(diào)控許多靶基因的轉(zhuǎn)錄，具有多種生物學(xué)效應(yīng)，在許多缺氧性疾病的病理過(guò)程中都發(fā)揮著重要的作用，因此是針對(duì)缺氧的最主要的應(yīng)答因子之一。HIF—1由α亞基(HIF—1α)和β亞基(HIF—1β)組成。HIF—1α為HIF—1所特有，受氧調(diào)節(jié)，在功能調(diào)控方面起主要作

2、用。HIF—1β又稱為芳香烴受體核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator，ARNT)為哺乳動(dòng)物芳香烴受體復(fù)合物的亞基，在細(xì)胞漿中穩(wěn)定表達(dá)。在正常氧飽和度下，HIF—1α亞基在翻譯后即被泛素—蛋白酶水解復(fù)合體迅速降解，半衰期僅為5min，因此細(xì)胞中基本檢測(cè)不到α亞基的表達(dá)，而在缺氧狀態(tài)下，α亞基的降解被抑制，α亞基和β亞基形成有活性的HIF—1，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)調(diào)節(jié)多種基因的轉(zhuǎn)

3、錄。受到HIF—1調(diào)節(jié)的靶基因多達(dá)二百多種，這些基因表達(dá)后參與紅細(xì)胞生成，血管形成，核苷、氨基酸、糖的能量代謝，細(xì)胞存活、凋亡和活動(dòng)以及藥物抵抗等生物學(xué)效應(yīng)，以維持組織、細(xì)胞在缺氧條件下內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，以適應(yīng)缺氧。特別是在生理缺氧狀態(tài)下，如胚胎發(fā)育過(guò)程中干細(xì)胞的增殖與分化，以及多種病理情況如腫瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)移中，HIF—1及其下游基因均發(fā)揮著重要作用。正因?yàn)镠IF—1α亞基在正常氧飽和度下翻譯后即被泛素—蛋白酶水解復(fù)合體迅速降解，半衰期僅為5

4、min，因此細(xì)胞中基本檢測(cè)不到α亞基的表達(dá)。使得關(guān)于HIF—1的研究受到極大的限制。本實(shí)驗(yàn)采用基因工程技術(shù)，體外構(gòu)建pHIF—1α/EGFP—C2真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒載體，使得被轉(zhuǎn)染細(xì)胞能持續(xù)高水平表達(dá)HIF—1α。解決了HIF—1α脫離缺氧環(huán)境即迅速降解的難題。 方法：1.細(xì)胞培養(yǎng)：應(yīng)用10％DMEM培養(yǎng)基(含10％FBS、100U/ml青鏈霉素)培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞(D3系)與人腎癌細(xì)胞(A498)于37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱，每

5、3d換液1次，待細(xì)胞沿培養(yǎng)皿底部生長(zhǎng)面積達(dá)80％—90％時(shí)，按常規(guī)方法傳代。兩種細(xì)胞分別給予氯化鈷(200uM)和3％O2缺氧培養(yǎng)兩種誘導(dǎo)方法處理4h、6h、16h。以37℃，5％CO2常規(guī)培養(yǎng)的D3小鼠胚胎干細(xì)胞組與A498人腎癌細(xì)胞作為對(duì)照。2.HIF—1α cDNA基因片段提?。禾崛】俶RNA，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)mRNA完整性。以500ng總mRNA為模板，以Random9引物反轉(zhuǎn)錄為cDNA進(jìn)行RT反應(yīng)。以此cDNA為模板，

6、PCR擴(kuò)增目的基因片段。1％瓊脂糖凝膠電泳。3.pHIF—1α-T原核細(xì)胞擴(kuò)增載體構(gòu)建：瓊脂糖凝膠回收PCR擴(kuò)增HIF—1α基因片段，與線性T載體連接。轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞、藍(lán)白篩選、質(zhì)粒提取均嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作。以SacⅠ酶和ApaⅠ酶進(jìn)行雙酶切37℃，2h，1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。以M13—47、RV—M引物，DNA測(cè)序。4.pHIF—1α/EGFP真核細(xì)胞表達(dá)載體構(gòu)建：(1) HIF—1α cDNA基因片段的制備。(2) pEG

7、FP—C2載體處理。(3) T4 DNA連接酶連接pEGFP—C2載體與HIF—1αcDNA基因片段。轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。鋪含卡娜霉素(100ug/ml)的LB瓊脂平板篩選白色菌落，挑取數(shù)個(gè)菌落擴(kuò)增后，提取質(zhì)粒。以SacⅠ酶和ApaⅠ酶進(jìn)行雙酶切37℃，2h，1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。以PCR引物，DNA測(cè)序。 結(jié)果：1.HIF—1α的RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，僅A498人腎癌細(xì)胞缺氧培養(yǎng)組見(jiàn)特異性擴(kuò)增條帶，分

8、子量與理論預(yù)期相符，未見(jiàn)非特異擴(kuò)增雜帶。并且隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，HIF—1α mRNA的轉(zhuǎn)錄水平逐漸提高。其它組均未見(jiàn)特異性擴(kuò)增條帶。2.pHIF—1α-T擴(kuò)增載體被雙酶切后產(chǎn)生2.6kb與1.7kb兩條片段。pHIF—1α-T擴(kuò)增載體的測(cè)序結(jié)果表明，DNA序列與Genebank所公布的相關(guān)序列(NM001530)相同，無(wú)突變和移碼。3.pHIF—1α/EGFP—C2載體酶切后會(huì)產(chǎn)生4.7kb與1.7kb兩條片段。pHIF—1α/EGF